牛乳中沙门氏菌的直接荧光定量pcr的检测引物、探针及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及牛乳中沙门氏菌的直接荧光定 量PCR的检测引物、探针及检测方法。
【背景技术】
[0002] 沙门氏菌（Salmonella)是对人类和动物健康构成严重危害的一类致病菌，也是 引起人类食物中毒最常见的病原菌。2012年卫生部发布最新食品安全标准规定，沙门氏菌 在各类食品中的限量值均为〇,即任何食品中都不得检出沙门氏菌。
[0003] 据统计，在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜 首，中国内陆地区也以沙门氏菌为首位。沙门氏菌广泛存在于自然界，对外界环境有一定的 抵抗力，在水、牛奶、肉类和蛋类制品中可存活数周至数月，在粪便中可存活1~10个月。
[0004] 关于沙门氏菌的检测方法，我国现行的国家和行业标准，从样本的制备、前增菌、 增菌、选择性分离培养和生化鉴定等，需要4~7天才能完成。相比之下，酶联免疫吸附 (ELISA)免疫学方法具有快速、简单等特点，但该类方法在灵敏性和特异性方面仍存在一定 不足。聚合酶链式反应（PCR)技术由于灵敏性和特异性较高，已经成为沙门氏菌检测常用 方法。常规PCR需要进行后续电泳鉴定，易发生交叉污染而产生假阳性，且操作耗时较长； 相比之下，荧光定量PCR技术（real-time PCR)具有更高的灵敏性，且无需PCR后续处理， 能有效避免交叉污染并提高检测效率。
[0005] 然而，目前基于PCR检测沙门氏菌的方法都要进行细菌DNA提取，然后以DNA为模 板进行检测；这一提取步骤无疑大大增加了检测工作量、时间和成本，也难以实现野外现场 及高通量检测；牛乳易受细菌感染而变质，现有检测沙门氏菌的PCR方法，因为费时太长而 不适于进行牛乳中沙门氏菌的检测。
[0006] 因此，现有的基于PCR检测牛乳中沙门氏菌的方法还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0007] 基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种新的沙门氏菌的检测 方法，以及该检测方法所使用的引物和探针。本发明的方法是一种无需提取细菌DNA就能 直接检测牛乳中沙门氏菌的直接荧光定量PCR方法。
[0008] 为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
[0009] -种牛乳中沙门氏菌的直接荧光定量PCR的检测引物，所述检测引物如SEQ ID No:l 和 SEQ ID No:2 所示。
[0010] -种牛乳中沙门氏菌的直接荧光定量PCR的检测探针，所述检测探针如SEQ ID No:3所示。
[0011] -种牛乳中沙门氏菌的直接荧光定量PCR的检测方法，使用上述检测引物和检测 探针进行检测，包括以下步骤：
[0012] 将牛乳样本直接加至荧光定量PCR反应体系中，进行荧光定量PCR;其中，所述荧 光定量PCR反应体系为：
[0013] 10 X Reaction buffer 2.5 μ! Alpha Taq 0,25 土 0.1 μL SEQ ID No: 1 0.3 ：f~ 0,1 μ,Μ. SEQ ID No;2 0,3 ±0,1 μΜ
[0014] SEQID No:3 0 J 士 0,1 μΜ PEC 12,5 *2 μL 含沙Π 氏菌的牛乳 1.25~7.5 μL 去离子水 加至25沖
[0015] 所述荧光定量PCR的反应程序为：95°C反应2min ;95°C变性58,60±11：退火/延 伸40s，反应35~45个循环。
[0016] 在其中一个实施例中，所述PCR反应体系为：
[0017] !0 >? Eeaetioa buffer 2,5 μL Alpha Taq ? 25 ul SEQ ID No: 1 0.3 μΜ SEQ ID No:2 0.3 μΜ SEQID No;3 0.2 μΜ PEC 12,5 μL 含沙门氏菌的牛乳 1.25~5 μL 去离了·水 加至25μ1
[0018] 在其中一个实施例中，所述荧光定量PCR的反应程序为：95°C反应2min ;94°C变性 5s，60°C退火/延伸40s，反应40个循环。
[0019] 本发明提供了一种无需提取细菌DNA就能直接检测牛乳中沙门氏菌的直接荧光 定量PCR方法。该直接荧光定量PCR技术由于具有以下几点特别之处而实现了无需从牛乳 中提取细菌DNA的目的，从而有效克服了传统PCR技术需要提取DNA而带来的耗时较长、操 作繁琐、提取困难、交叉感染等诸多难题：
[0020] 1、本发明使用了一种高耐受性DNA聚合酶（Alpha Taq)
[0021] 在原始生物样本中，往往含有大量抑制PCR的物质，比如牛奶中含有较多乳铁蛋 白，全血（或血清、血浆）中含有大量免疫球蛋白、血红蛋白、亚铁血红素，土壤中含有较多 腐殖酸等。这些物质会强烈抑制DNA聚合酶的活性，使PCR失效，这是传统PCR技术必须 提取细菌DNA的重要原因。本发明直接荧光定量PCR方法使用高耐受DNA聚合酶（Alpha Taq)，该酶通过基因工程手段对DNA聚合酶的编码序列进行改造，将第708位的谷氨酸突变 为赖氨酸（E708K)或谷氨酰胺（E708Q)，使得突变酶能够耐受高达2. 6~5. 2mM乳铁蛋白或 20%的全血、0.2~0.4以8/1111腐殖酸等。
[0022] 2、本发明使用 了一种 PCR 增强剂（PCR enhancer, PEC)
[0023] 该PCR增强剂由肉碱（L-carnitine)、海藻糖（D-(+)_trehalose)、非离子去污剂 NP-40组成，既能提高含较高GC含量基因的扩增效率，又能增加反应体系对PCR抑制物质 的耐受性。此外，某些抑制物质（如血红蛋白）会造成荧光定量PCR的荧光淬灭，这是传统 PCR技术必须提取细菌DNA进行检测的另一重要原因。而PCR增强剂，能够有效降低抑制物 质的荧光淬灭效应。因此，本发明的直接荧光定量PCR方法能使用染料法或探针法，进行细 菌DNA的实时荧光定量PCR检测。
[0024] 此外，要成功实现直接荧光定量PCR，细菌DNA的有效释放是又一重要影响因素。 本发明发明人经过大量摸索，发现在95°C反应2min，可实现细菌DNA的有效释放。PCR增强 剂中含有非离子去污剂NP-40,这有助于裂解细菌细胞壁来释放DNA。
[0025] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0026] 1、本发明中的检测引物和探针，适用于沙门氏菌的直接荧光定量PCR检测，灵敏 度高，特异性强；
[0027] 2、本发明的检测方法直接将牛乳加入反应体系，在一个PCR管中连续、自动实现 细菌DNA的释放和荧光定量PCR检测；实现了无需提取细菌DNA、直接从牛乳中检测沙门氏 菌的目的，从得到牛乳样本到获得检测结果只需要1个小时；有效克服了传统PCR需要提取 DNA的不足，能大大减少操作步骤，大幅度提高检测速度，节省成本，有效避免交叉污染，并 能实现牛乳样本的野外现场检测；
[0028] 3、本发明的检测方法的灵敏性不低于传统PCR ;对于难以提取DNA的痕量样本的 检测效果也很好；
[0029] 4、本发明的检测方法能进行沙门氏菌的高通量检测，对于快速发现牛乳中沙门氏 菌感染疫情，及时制定防控措施具有重要而深远的意义。
【附图说明】
[0030] 图1为直接荧光定量PCR与传统荧光定量PCR方法的比较图。其中，从左至右的 扩增曲线分别为扩增曲线1-4,扩增曲线1为2X10scfu/ml浓度样品直接荧光定量PCR的 扩增曲线，扩增曲线2为2 X 10scfU/ml浓度样品传统荧光定量PCR的扩增曲线、扩增曲线3 为2 X 104cfu/ml浓度样品直接荧光定量PCR的扩增曲线，扩增曲线4为2 X 104cfu/ml浓度 样品传统荧光定量PCR的扩增曲线。
[0031] 图2为本发明实施例2中用直接荧光定量PCR对牛乳中沙门氏菌检测灵敏度的分 析图。图2A为不同浓度沙门氏菌的直接荧光定量PCR扩增曲线，从左至右的扩增曲线分别 为扩增曲线1-11，扩增曲线1-11分别为表1中管号1-11样品的直接荧光定量PCR扩增曲 线；图2B为沙门氏菌浓度与扩增循环数（Ct值）之间的相关系数。
[0032] 图3为本发明实施例3中用直接荧光定量PCR对牛乳中沙门氏菌检测稳定性的分 析图。
[0033] 图4为本发明实施例4中使用的直接荧光定量PCR对牛乳浓度耐受性的分析图。 图4A为不同牛乳浓度反应体系的浑浊程度图；图4B为不同牛乳浓度下直接荧光定量PCR 检测沙门氏菌的Ct值。
【具体实施方式】
[0034] 为了更好的理解本发明，以下结合附图和具体实施例来作进一步详细说明。本发 明中所述的直接荧光定量PCR方法是指无需提取细菌DNA就能直接检测的荧光定量PCR方 法。
[0035] 以下实施例中涉及的实验材料如下：
[0036] 1.沙门氏菌纯菌（ATCC 13312)，含沙门氏菌的牛乳，沙门氏菌阴性牛乳。
[0037] 2.试剂：Alpha Taq (VitaNavi Technology)，PEC (VitaNavi Technology) 〇
[0038] 3.仪器：突光定量 PCR 仪（StepOne Plus, ABI)，冷冻离心机（5804R, Eppendorf)， 核酸电泳仪（EPS-100,上海天能），凝胶成像系统（Dolphin-Doc，WEALTEC)。
[0039] 如无特殊说明，以下实施例中所采用的操作均为本领域技术人员所熟知的常规操 作。
[0040] 实施例1沙门氏菌的直接荧光定量PCR检测方法
[0041] 1、特异引物和探针的设计
[0042] 根据沙门氏菌型分泌系统蛋白INvA的序列来设计，如下：