一种用于检测大豆疫霉的试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种试剂盒，具体是一种用于检测大豆疫霉的试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002]由大豆疫霉菌侵染大豆引起的疫霉根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一，也是我国对外公布的一类检疫对象。大豆疫霉菌可以在大豆生长的各个时期侵染大豆，在潮湿多雨的季节病害发生尤其严重，由于大豆疫霉以同宗配合的方式进行有性生殖，在发病植株上可以产生大量的卵孢子，植物收获后残留在土壤中的卵孢子就成为大豆疫霉的初侵染源，据报道大豆疫霉的卵孢子可以在土壤中存活5年以上。因此大豆疫霉根腐病一旦发生将很难消除。
[0003]传统的检测大豆疫霉的方法是进行大豆叶碟诱捕和平板培养或者将二者相结合；传统方法在大豆疫霉检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉分离、形态学鉴定知识和丰富的经验，所以很难在生产中推广运用。
[0004]PCR技术具有快速和灵敏的优点，在病原物的鉴定和检测中的地位越来越重要。近年来，一些疫霉菌的PCR检测方法被开发出来。这些方法中设计的引物的来源主要都是转录间隔区，这些区域或者基因在基因组中都是高拷贝的，所以很容易被检测到。但是越来越多的研究发现，部分疫霉种的ITS序列差异很小，以此为靶标设计的引物难以将这些疫霉菌与其近缘种区分开来。根据ITS序列设计大豆疫霉特异性引物时发现，大豆疫霉与P.melonis的ITS序列的相似性高达97 %，大豆疫霉的特异性引物3’末端仅仅与P.melonis的相应序列相差1个碱基，需要将退火温度提高到66°C以上才能将这两种疫霉区分开来，但是过高的退火温度会降低PCR反应的灵敏度，而且提高退火温度并不能彻底解决此问题，当P.melonis的浓度较高时仍然会造成假阳性的现象。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种结构简单、使用方便的用于检测大豆疫霉的试剂盒及其检测方法，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0006]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
一种用于检测大豆疫霉的试剂盒，包括用于检测大豆疫霉的引物、4种dNTP、10XPCR反应缓冲液、2mM的Mg2+、Tris.Cl溶液、KC1溶液、1 % BSA和Taq酶，所述用于检测大豆疫霉的引物包括两对引物，第一对引物其上游引物核苷酸序列如SEQIDN0.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDN0.2所述，第二对引物其上游引物核苷酸序列如SEQIDN0.3所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDN0.4所述。
[0007]所述用于检测大豆疫霉的试剂盒的检测方法，具体步骤如下:
(1)提取待测样品的DNA，进行套式PCR反应，所述套式PCR反应包括第一轮PCR反应和第二轮PCR反应；
(2)第一轮PCR反应的模板为提取待测样品的DNA，引物为所述的第二对引物，第一轮PCR 反应的 PCR 扩增程序为 92-96 °C变性 4_6min，92-96 °C 变性 0.5-1.5min ;50_70°C 退火20-40s ;68-76°C延伸 0.5-1.5min ；35 个循环，最后 68-76。。延伸 lOmin ；
(3)第二轮PCR反应的模板为第一轮PCR反应产物，引物为所述的第一对引物，第二轮PCR 反应的 PCR 扩增程序为 94-98 °C变性 3_5min，94-98 °C 变性 0.5-1.5min ;55_75°C 退火20-40s ;68-76°C延伸 0.5-1.5min ；37 个循环，最后 68-76。。延伸 lOmin ；
(4)取第二轮PCR反应的扩增产物进行检测，若存在分子量约为220bp的DNA条带，则证明所检样品中含有大豆疫霉。
[0008]作为本发明再进一步的方案:对所述PCR反应扩增产物的检测为凝胶电泳检测。
[0009]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
本发明结构简单、操作简单，实用性好，用卵孢子富集的方法检测含卵孢子土壤具有重要的实际应用价值，大大提高了检测效率，准确性高，由于可以有效的富集卵孢子，而且PCR扩增的高灵敏度，从而可以有效地从每克含有一个卵孢子的土壤中检测出卵孢子，灵敏度尚ο
【具体实施方式】
[0010]下面结合【具体实施方式】对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
[0011]实施例1
一种用于检测大豆疫霉的试剂盒，包括用于检测大豆疫霉的引物、4种dNTP、10XPCR反应缓冲液、2mM的Mg2+、Tris.Cl溶液、KC1溶液、1 % BSA和Taq酶，所述用于检测大豆疫霉的引物包括两对引物，第一对引物其上游引物核苷酸序列如SEQIDN0.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDN0.2所述，第二对引物其上游引物核苷酸序列如SEQIDN0.3所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDN0.4所述。
[0012]所述用于检测大豆疫霉的试剂盒的检测方法，具体步骤如下:
(1)提取待测样品的DNA，进行套式PCR反应，所述套式PCR反应包括第一轮PCR反应和第二轮PCR反应；
(2)第一轮PCR反应的模板为提取待测样品的DNA，引物为所述的第二对引物，第一轮PCR反应的PCR扩增程序为92°(:变性411^11，92°(:变性0.5min ;50°C退火20s ;68°C延伸
0.5min ；35个循环，最后68°C延伸lOmin ；
(3)第二轮PCR反应的模板为第一轮PCR反应产物，引物为所述的第一对引物，第二轮PCR反应的PCR扩增程序为94°C变性3min，94°C变性0.5min ;55°C退火20s ;68°C延伸
0.5min ；37个循环，最后68°C延伸lOmin ；
(4)取第二轮PCR反应的扩增产物进行检测，若存在分子量约为220bp的DNA条带，则证明所检样品中含有大豆疫霉。
[0013]实施例2
一种用于检测大豆疫霉的试剂盒，包括用于检测大豆疫霉的引物、4种dNTP、10XPCR反应缓冲液、2mM的Mg2+、Tris.Cl溶液、KC1溶液、1 % BSA和Taq酶，所述用于检测大豆疫霉的引物包括两对引物，第一对引物其上游引物核苷酸序列如SEQIDN0.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDN0.2所述，第二对引物其上游引物核苷酸序列如SEQIDN0.3所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDN0.4所述。
[0014]所述用于检测大豆疫霉的试剂盒的检测方法，具体步骤如下:
(1)提取待测样品的DNA，进行套式PCR反应，所述套式PCR反应包括第一轮PCR反应和第二轮PCR反应；
(2)第一轮PCR反应的模板为提取待测样品的DNA，引物为所述的第二对引物，第一轮PCR反应的PCR扩增程序为94°C变性5min，94°C变性lmin ;60°C退火30s ;72°C延伸lmin ；35个循环，最后72°C延伸lOmin ；
(3)第二轮PCR反应的模板为第一轮PCR反应产物，引物为所述的第一对引物，第二轮PCR反应的PCR扩增程序为96°C变性4min，96°C变性lmin ;65°C退火30s ;72°C延伸lmin ；37个循环，最后72°C延伸lOmin ；
(4)取第二轮PCR反应的扩增产物进行检测，若存在分子量约为220bp的DNA条带，则证明所检样品中含有大豆疫霉。
[0015]实施例3
一种用于检测大豆疫霉的试剂盒，包括用于检测大豆疫霉的引物、4种dNTP、10XPCR反应缓冲液、2mM的Mg2+、Tris.Cl溶液、KC1溶液、1 % BSA和Taq酶，所述用于检测大豆疫霉的引物包括两对引物，第一对引物其上游引物核苷酸序列如SEQIDN0.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDN0.2所述，第二对引物其上游引物核苷酸序列如SEQIDN0.3所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDN0.4所述。
[0016]所述用于检测大豆疫霉的试剂盒的检测方法，具体步骤如下:
(1)提取待测样品的DNA，进行套式PCR反应，所述套式PCR反应包括第一轮PCR反应和第二轮PCR反应；
(2)第一轮PCR反应的模板为提取待测样品的DNA，引物为所述的第二对引物，第一轮PCR反应的PCR扩增程序为96°C变性6min，96°C变性1.5min ;70°C退火40s ;76°C延伸1.5min ；35个循环，最后76°C延伸lOmin ；
(3)第二轮PCR反应的模板为第一轮PCR反应产物，引物为所述的第一对引物，第二轮PCR反应的PCR扩增程序为98°C变性5min，98°C变性1.5min ;75°C退火40s ;76°C延伸
1.5min ；37个循环，最后76°C延伸lOmin ；
(4)取第二轮PCR反应的扩增产物进行检测，若存在分子量约为220bp的DNA条带，则证明所检样品中含有大豆疫霉。
[0017]设计、合成引物并建立大豆疫霉检测试剂盒的PCR反应体系
一、引物设计与合成:根据大豆疫霉类转座子序列设计一对用于大豆疫霉分子检测的特异引物TrapFl/TrapRl (具体见核苷酸序列表SEQIDN0.1和SEQIDN0.2)，为了提高检测的灵敏度，本发明基于该序列设计另一对引物TrapF2/TrapR2(具体见核苷酸序列表SEQIDN0.3和SEQIDN0.4)，作为套式PCR的第二轮扩增引物。
[0018]二、建立常规PCR反应体系:PCR反应的混合液总体积为30 μ 1，包括:相应浓度的模板 DNA，0.5 μ MTrapFl/TrapRl 引物，4 种 dNTP 各 50 μ M，2.5 μ 110 XPCR 反应缓冲液，2mM的 Mg2+，3.8 μ Tris.Cl 溶液，4.2 μ KC1 溶液，2.5 μ 11% BSA, 1.25 单位 Taq 酶(TaKaRa)，在PTC200 (MJ公司)PCR仪上进行扩增反应。反应程序为:92°C预变性5min ;然后进入循环，94°C变性30sec，65°C退火30sec，72°C延伸30sec，共35个循环；最后72°C延伸7min。反应结束后取7 μ 1扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳30min(100V)，在凝胶成像系统上检测并拍照，如果存在分子量约为267bp的DNA条带，则证明所检样品中含有大豆疫霉。
[0019]三、建立套式PCR反应体系:为了提高检测灵敏度，进一步建立了套式PCR反应体系。以TrapFl/TrapRl作为第一轮反应引物与引物