Znrd1基因及其表达产物作为颅内动脉瘤的诊治靶标的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地涉及人ZNRD1基因在颅内动脉瘤的诊断、治疗 中的用途。
【背景技术】
[0002] 卢页内动脉瘤（Intracranial Aneurysm)是指多种因素造成的颜内动脉壁结构破 坏，进而导致的动脉壁异常膨出。颅内动脉瘤发病率较高，尸体解剖检出率约为1-5%。颅 内动脉瘤破裂出血后30天的死亡率达45%，存活者中30%存在不同程度的残疾，严重威胁 人类的生命健康。然而，关于颅内动脉瘤的发病机制并不明确，其可能与遗传、高血压、血流 动力学、获得性血管壁损伤有关。
[0003] 如果在IA破裂之前进行有效的预防和处理，患者的总体预后将大大改善。当前， 对颅内动脉瘤的诊断和筛选主要依赖脑血管造影（DSA)和磁共振血管造影（MRA)及CT血 管造影（CTA)。三种方法均存在费用昂贵、假阴性率高的缺点，同时作为金标准的DSA还是 一种有创性检查，难以被普通人群所接受，因此临床上迫切需要改变当前的诊治格局，以便 对IA患者作出早期诊断和筛选，并进行相应的有效处理，最终改善患者的总体预后。
【发明内容】
[0004] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于颅内动脉瘤早期诊 断的分子标志物。相比传统的颅内动脉瘤的诊断方法，使用基因标志物来诊断颅内动脉瘤 的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高 低，采取相应的预防和治疗措施。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 本发明提供了检测ZNRD1基因表达的产品在制备诊断颅内动脉瘤的工具中的应 用。
[0007] 进一步，所述检测ZNRD1基因表达的产品包括检测ZNRD1基因 mRNA水平的产品、 和/或检测ZNRD1蛋白水平的产品。
[0008] 进一步，所述检测ZNRD1基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检 测、原位杂交或芯片检测ZNRD1基因及其表达产物的表达水平以诊断颅内动脉瘤的产品。
[0009] 进一步，所述用RT-PCR诊断颅内动脉瘤的产品至少包括一对特异扩增ZNRD1基因 的引物；所述用实时定量PCR诊断颅内动脉瘤的产品至少包括一对特异扩增ZNRD1基因的 引物；所述用免疫检测诊断颅内动脉瘤的产品包括：与ZNRD1蛋白特异性结合的抗体；所述 用原位杂交诊断颅内动脉瘤的产品包括：与ZNRD1基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯 片诊断颅内动脉瘤的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与ZNRD1蛋白特 异性结合的抗体，基因芯片包括与ZNRD1基因的核酸序列杂交的探针。
[0010] 所述用实时定量PCR诊断颅内动脉瘤的产品至少包括的一对特异扩增ZNRD1基因 的引物如SEQ ID N0. 11和SEQ ID N0. 12所示。
[0011] 所述检测ZNRD1基因表达的产品可以是检测ZNRD1基因表达的试剂、也可以是包 含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。
[0012] 所述诊断颅内动脉瘤的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平 台；高通量测序平台是一种特殊的诊断颅内动脉瘤的工具，随着高通量测序技术的发展，对 一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因 表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知ZNRD1基因的 异常与颅内动脉瘤相关也属于ZNRD1基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
[0013] 本发明还提供了一种诊断颅内动脉瘤的工具，所述工具包括检测ZNRD1基因表达 的试剂；所述试剂包括检测ZNRD1基因 mRNA的引物和/或探针、和/或检测ZNRD1蛋白的 抗体。
[0014] 所述工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。
[0015] 其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固 定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测ZNRD1基因转录水平的 针对ZNRD1基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的 ZNRD1蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括ZNRD1基因在内的多个基因（例 如，与颅内动脉瘤相关的多个基因）的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括ZNRD1 蛋白在内的多个蛋白质（例如与颅内动脉瘤相关的多个蛋白质）的表达水平。通过将多个 与颅内动脉瘤的标志物同时检测，可大大提高颅内动脉瘤诊断的准确率。
[0016] 其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试 剂盒包括用于检测ZNRD1基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括ZNRD1蛋白 的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯 片方法检测ZNRD1基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对ZNRD1基 因的引物和/或探针。根据ZNRD1基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测ZNRD1 基因表达水平的引物和探针。
[0017] 所述试纸包括检测ZNRD1基因表达的试剂。
[0018] 所述高通量测序平台包括检测ZNRD1基因表达的试剂。
[0019] 与ZNRD1基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其 它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结 合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述 探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针 长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最 长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探 针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
[0020] 进一步，所述ZNRD1蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述ZNRD1 蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰（例如，，嵌合抗体、scFv、 Fab、F(ab'）2、Fv等。只要所述片段能够保留与ZNRD1蛋白的结合能力即可。用于蛋白质 水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗 体。
[0021] 在本发明的具体实施方案中，所述检测ZNRD1基因 mRNA的引物包括SEQ ID N0. 11 和SEQ ID NO. 12所示的引物对。
[0022] 本发明还提供了 ZNRD1基因和/或其表达产物的促进剂在制备治疗颅内动脉瘤的 药物中的应用。
[0023] 所述促进剂包括促进ZNRD1基因表达的试剂和促进ZNRD1基因表达产物的试 剂；所述促进ZNRD1基因表达的试剂包括促进基因转录的试剂、促进基因翻译的试剂、促进 ZNRD1蛋白含量的试剂；所述促进ZNRD1基因表达产物的试剂包括促进ZNRD1基因表达产 物稳定性的试剂、促进ZNRD1基因表达产物活性的试剂、促进ZNRD1基因表达产物功能的试 剂。
[0024] 具体地，所述促进ZNRD1基因表达的试剂包括：含有ZNRD1基因的试剂、携带 ZNRD1基因的载体或宿主细胞所形成的试剂、含有ZNRD1蛋白质的试剂。
[0025] 本发明的促进剂一方面可以用于补充内源性的ZNRD1蛋白的缺失或不足，通过提 尚ZNRD1蛋白的表达，从而治疗因 ZNRD1蛋白缺之导致的卢页内动脉瘤。另一方面可以用于 促进ZNRD1蛋白的活性或者功能，从而治疗颅内动脉瘤。
[0026] 本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、 粘粒、噬菌体、病毒等。
[0027] 在本发明中，术语"宿主细胞"包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的 例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物 细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CH0细胞、C0S细胞等。
[0028] 本发明还提供了一种用于治疗颅内动脉瘤的药物组合物，所述药物组合物包括上 面所述的ZNRD1基因和/或其表达产物的促进剂。
[0029] 进一步，本发明的药物还包括药学上可接受的载体，载体，这类载体包括（但并不 限于）：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明 胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵 化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙 和镁、聚乙二醇等。
[0030] 本发明的药物导入组织或者细胞的方式可以分为体外或者体内的方式。体外方 式包括将含有ZNRD1基因的药物或者含有ZNRD1蛋白质的药物导入细胞中，再将细胞移植 或回输到体内。体内方式包括直接将含有ZNRD1基因的药物或者含有ZNRD1蛋白质的药物 注入体内组织中。
[0031] 本发明的药物还可与其他治疗颅内动脉瘤的药物联用，多种药物联合使用可以大 大提到治疗的成功率。
[0032] 在本发明的上下文中，"ZNRD1基因"包括ZNRD1基因以及ZNRD1基因的任何功能 等同物的多核苷酸。ZNRD1基因包括与目前国际公共核酸序列数据库