检测人巨细胞病毒pp65基因的方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及荧光探针PCR检测人巨细胞病毒PP65基因 的方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 人巨细胞病毒（Human Cytomegalovirus, HCMV)，属于疱瘆病毒科β亚科，是一种 双螺旋DNA病毒。HCMV呈世界性分布，在人群中广泛传播，在人体感染过程中，分为急性感 染和潜伏感染，一经感染，人体将终身携带。HCMV多以潜伏感染形式存在于人体多种细胞 中，在免疫系统功能正常的人体中，潜伏感染不致病，但HCMV感染在孕妇和婴幼儿等免疫 功能低下的人群中，可导致包括致死在内的严重后果。妊娠期妇女由于其内分泌和免疫状 态的改变可使体内潜伏的HCMV被激活，通过母婴垂直传播给胎儿，导致死胎、流产、胎儿发 育迟缓及多种机型。此外，自身免疫病患者、接受免疫抑制治疗患者、以及接受化疗、放疗的 肿瘤或器官骨髓移植的患者等极易通过感染而发生HCMV急性感染，引起诸如HCMV肝炎、肺 炎、单核细胞增多症等HCMV致病表现。如当骨髓移植，肝、肾、心脏等器官移植患者免疫功 能受损时，潜伏病毒被激活、增值而发生严重感染，将导致患者器官移植失败甚至死亡。
[0003] 研究表明，一旦出现HCMV感染的临床症状，抗病毒药物不能控制该病的病理进 程，这意味着抗病毒药物必须在HCMV感染的临床症状出现前就使用，这就有赖于实验室的 分析。
[0004] HCMV感染的常用检测方法有病毒分离培养法和血清学方法。病毒分离培养法为 HCMV实验室诊断的金标准，但培养所需时间过长，一般5-10天，结果受标本保存时间影响 大，且分离培养条件和技术要求高，不适合大范围推广作为临床常规检测。血清学主要检测 HCMV-IgG和IgM，IgG阳性仅能提示人体曾感染HCMV，不能证明是否为HCMV急性感染；IgM 阳性表明存在急性感染，但针对免疫功能低下的患者，机体难以产生足够量的IgM，因此存 在大量假阴性结果，且不能区分潜伏感染和活动性感染。抗原血症检测技术是一项快速、敏 感的诊断技术，但是传统检测方法多以白细胞为病毒抗原检测载体，限制了其临床应用。
[0005] PP65是HCMV病毒复制的早期蛋白，它出现于病毒感染的早期，在细胞感染后3-4 小时即开始出现，是HCMV病毒含量最丰富的蛋白。其功能是将病毒的DNA锚定在受感染细 胞的核膜上，在胞浆的高尔基体内合成，然后运回核内。随着研究的深入，HCMV-PP65抗原 被认为是HCMV感染表达的早期抗原，PP65抗原分析能敏感地在早期预测HCMV病。申请号 为201310549511. 4的发明专利公开了一种应用免疫荧光技术检测HCMV PP65抗原，利用与 PP65具有特异性的适配子，构建了一种磁珠-适配子-抗原-单克隆抗体复合体，提高了 PP65检验效率。申请号为201310549370. 6的发明专利公开了一种基于生物芯片快速检测 PP65的方法，利用与PP65具有特异性的适配子，应用生物芯片技术检测HCMVPP65抗原，提 高了 PP65检验效率。申请号为201410040889. 6的发明专利公开了一种检测人巨细胞病毒 (HCMV) PP65抗原的ELISA方法，包括以下步骤：（1)制备检测试剂盒：包被有大鼠抗重组 PP65322-561多克隆抗体（pAb)的酶标板、兔抗重组PP65322-561pAb、标准品、HRP-羊抗兔 IgG、PBST洗涤液、底物显色液、终止液和封板膜；（2)制备待测标本；（3)检测人巨细胞病 毒PP65抗原。
[0006] 核酸检验作为一种医学检验技术已经在感染性病原体诊断中体现出了巨大的优 势和作用。现有HCMV试剂盒大多检测外周血，采集标本会造成创伤，且存在灵敏度低、稳定 性差等缺点。研发无创性、高灵敏度和高特异性的HCMV核酸检测试剂盒对诊断HCMV感染 有着积极的意义。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种检测人巨细胞病毒PP65基因的方法， 该方法操作简单，具有无创性、灵敏度高和特异性高的优点，适用于临床分子诊断。
[0008] 为实现上述目的，本发明的技术方案为： 一种检测人巨细胞病毒PP65基因的方法，所述的方法具体为： 从待测样本中提取DNA，以所得DNA为模板，采用特异性引物对和荧光标记探针进行 PCR扩增，进行实时荧光探针PCR检测；所述特异性引物对是序列如SEQ ID N0 :1所示的上 游引物PP65-F和序列如SEQ ID N0 :2所示的下游引物PP65-R ;所述荧光标记探针序列如 SEQ ID N0:3所示。荧光探针PCR检测是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信 号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在本 发明中，设计了一条带有FAM荧光素的荧光标记探针，其在PCR反应的退火期与PCR扩增的 目标互补单链DNA杂交，并被Taq DNA聚合酶的5'核酸外切酶活性水解，水解后FAM荧光 素将远离3'淬灭基团，从而在激发光作用下产生荧光信号。
[0009] 所述的一种检测人巨细胞病毒PP65基因的方法，所述的待测样本为临床尿液样 本，以尿液样本为待检测样本，实现了本发明的无创检测。
[0010] 所述的一种检测人巨细胞病毒PP65基因的方法，所述PCR扩增的反应体系： 2. 5 XPCR buffer (已包含 Taq DNA 聚合酶)8ul，20 X Enhancer buffer lul，10uM 上游引物 PP65-F lul，10uM 下游引物 PP65-F lul，10uM 探针 PP65-P 0.5ul，模板 DNA 2ul，其余为无 核酸酶的灭菌高纯双蒸水，终体积为20ul。
[0011] 所述的一种检测人巨细胞病毒PP65基因的方法，所述PCR扩增程序为：（1) 50°C 处理2分钟，95°C预变性2分钟；（2)按照95°C变性15秒，55°C退火40秒为一个循环，共循 环40次。
[0012] 本发明的目的之二在于提供一种用于检测人巨细胞病毒PP65基因的试剂盒，该 试剂盒对HCMVPP65基因进行PCR检测，有很好的特异性和灵敏度。
[0013] 为实现上述目的，本发明的技术方案为： 用于检测人巨细胞病毒PP65基因的试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增PP65基因的特 异性引物对，所述特异性引物对是序列如SEQ ID N0 :1所示的上游引物PP65-F和序列如 SEQ ID N0:2所示的下游引物PP65-R。利用特异性引物对可对待测样本的DNA进行特异性 扩增。
[0014] 进一步，所述试剂盒还包括荧光标记探针，所述荧光标记探针序列如SEQ ID N0 :3 所示，该试剂盒对HCMV进行荧光探针PCR检测，有很好的特异性和灵敏度。
[0015] 进一步，所述试剂盒还包括HCMV核酸标准品，所述的HCMV核酸标准品是将得到 的HCMVPP65基因序列连接到载体PBackZero-T vector上形成PBackZer〇-HCMVPP65质粒 即作为HCMV核酸标准品，利用标准品做成标准曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定 量分析。本发明中，HCMVPP65基因的序列是通过TA克隆连接到载体PBackZero-T vector 上进行克隆，得到PBackZer〇-HCMVPP65质粒。ΤΑ克隆技术（ΤΑ cloning)利用Taq聚合酶 具有末端转移酶（TdT)活性，但却不具有3' -5'端外切酶校准活性的特点，可在PCR产物的 3'端加上一个非模板依赖碱基"A"。pMD18-T是一种高效克隆PCR产物的专用载体，它是 由PUC18载体在Xba I和Sal I识别位点间插入一个EcoR V位点，然后用EcoR V进行酶 切使质粒线性化，并在它的3'端添加"T"构建而成。因其3'端带有一个突出的"T"尾，能 高效地与带"A"尾的PCR产物连接，极大地提高了克隆的效率。TA克隆是目前克隆PCR产 物最简便、快捷的方法。
[0016] 进一步，所述试剂盒还包括从待测样本中提取DNA的DNA提取试剂，所述的DNA提 取试剂为本领域提取DNA常用的试剂。
[0017] 进一步，所述试剂盒还包括对提取的DNA进行特异性扩增的PCR扩增试剂，如PCR 缓冲液、MgCl2溶液、dNTPs、DNA聚合酶等等。
[0018] 本发明的有益效果在于：（1)本发明的一种检测人巨细胞病毒PP65基因的方法， 该方法操作简单，具有无创性、灵敏度高和特异性高的优点，适用于临床分子诊断。（2)本发 明的用于检测人巨细胞病毒PP65基因的试剂盒对HCMVPP65基因进行PCR检测，有很好的 特异性和灵敏度。
[0019]
【附图说明】 图1为标准品PCR荧光曲线图； 图2为样本PCR荧光曲线图。
[0020]
【具体实施方式】 所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所 举实施例。所