含有海藻糖及葡聚糖的哺乳动物细胞移植用溶液的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及：在含有2. 0~6. 0(w/v) %的海藻糖或其衍生物或它们的盐（以下有 时称为"海藻糖类"）、和4. 0~7. 0(w/v) %的葡聚糖或其衍生物或它们的盐（以下有时称 为"葡聚糖类"）的细胞移植用生理性水溶液（以下有时称为"本申请的细胞移植用溶液"） 中保存哺乳动物细胞的方法；本申请的移植用溶液；和含有移植用细胞的生理性水溶液， 其含有哺乳动物细胞、和海藻糖类及葡聚糖类。
【背景技术】
[0002] 近年来，由于干细胞研究的迅速发展，向再生医疗中应用的形势高涨，其知识和理 解不仅在研究者中、在普通人中也得到了广泛普及。使用干细胞的再生医疗是以利用干细 胞所具有的自复制能力和多分化能力、干细胞分泌的因子来恢复因各种疾病而受到损伤的 细胞和组织的功能为目的的医疗。若对白血病、再生不良性贫血等血液疑难病患者进行骨 髓移植，造血干细胞在患者体内成活，在几乎一生内维持造血能力成为可能。此外，近来很 多研究者以使用除造血干细胞以外的干细胞的临床应用为目标，对中枢神经、末梢神经、骨 髓、小肠等中的干细胞进行鉴定，已开始实践针对外伤性疾病和组织变性疾病进行组织干 细胞移植治疗（非专利文献1~3)。另一方面，癌症免疫细胞疗法是将具有攻击癌症的功 能的免疫细胞取出至体外、强化其功能后再次移植回体内的最先进的细胞医疗，并已实践 了树突状细胞疫苗疗法、α β T细胞疗法、γ δ T细胞疗法、CTL疗法、自然杀伤细胞疗法（NK 细胞疗法）等利用Τ细胞的疗法。
[0003] 在长期保存用于移植治疗中的干细胞、Τ细胞时，通过在液体中的保存，无法良好 地维持细胞存活率。例如，已有报道称将人骨髓干细胞在生理盐水中冷藏保存（4°C)时， 细胞存活率在48小时后降低至40%以下，在72小时后降低至20%以下（非专利文献4)。 因此，长期保存移植用干细胞、移植用T细胞时，一般进行冷冻保存。但是，由于在冷冻保存 液中通常添加有DMS0、甘油等冷冻保存剂，因此，将经冷冻保存的干细胞、T细胞解冻之后， 需要在进行移植治疗之前除去移植冷冻保存剂，存在耗费劳力的问题。另外，即使在冷冻保 存液中添加冷冻保存剂，冷冻时的水的结晶化对细胞骨架的损伤也大，冻融后的细胞存活 率降低也成为问题。因此，当务之急是开发出简便性优异、且能够抑制细胞存活率的降低的 细胞保存液。
[0004] 另一方面，海藻糖（trehalose)为葡萄糖以1，1-糖苷键键合而成的二糖之一。海 藻糖呈甜味、且具有高的保水力，因此被用于各种食品、化妆品中。此外，海藻糖具有使细胞 膜稳定、抑制细胞损伤的性质，因此被用作移植器官时的器官保护液的有效成分。例如，已 研制了 ET-Kyoto液、New ET-Kyoto液等含有海藻糖的优异的器官保存液（专利文献1及 2,非专利文献5)。
[0005] 葡聚糖（dextran)是由葡萄糖形成的多糖类之一，作为增稠剂、保湿剂等广泛应 用于医药品、化妆品领域中。
[0006] 本申请的发明人已经报道了使用含有海藻糖的生理性水溶液清洗通过蛋白质分 解酶处理从细胞培养容器中剥离的间充质干细胞时，间充质干细胞的细胞死亡受到抑制 (专利文献3)。当由于蛋白质分解酶处理而导致细胞受到损伤时，细胞死亡（细胞凋亡等） 的途径将被诱导，故而可以认为，上述由海藻糖带来的效果是基于细胞凋亡途径被抑制或 细胞损伤的修复功能被促进而产生的。另外，本申请的发明人还报道了在间充质干细胞的 悬浮液中添加海藻糖、葡聚糖等糖类时，可以抑制短时间（30分钟~6小时）保存时的间充 质干细胞的凝集、存活率的降低（专利文献4)。但是，通过并用海藻糖和葡聚糖，是否能够 协同性地抑制间充质干细胞等哺乳动物细胞的细胞存活率降低、并协同性地提高活细胞的 比例尚不明确。
[0007] 现有技术文献
[0008] 专利文献
[0009] 专利文献1 :日本专利第3253131号公报
[0010] 专利文献2 :国际公开第2007/043698号小册子
[0011] 专利文献3 :国际公开第2012/133575号小册子
[0012] 专利文献4 :日本特开2012-115253号公报
[0013] 非专利文献
[0014] 非专利文献 1 :Gage，F.H. Science 287:1433-1438(2000)
[0015] 非专利文献 2 :Morrison, S. J. et al.，Cell 96:737-749(1999)
[0016] 非专利文献 3 :Batle，E. et al.，Cell 111:251-263(2002)
[0017] 非专利文献 4 :Lane, T. A. et al·，Transfusion 49:14了1-1481 (2〇〇9)
[0018] 非专利文献 5 :Chem，F.et al.，Yonsei Med. J. 45:1107-1114 (2004)
【发明内容】
[0019] 本发明的课题在于提供能够有效地抑制保存哺乳动物细胞时的细胞死亡的细胞 移植用溶液、和使用所述细胞移植用溶液长期保存哺乳动物细胞的方法。
[0020] 如上文所述，本申请的发明人已报道了在添加有海藻糖、葡聚糖等糖类的溶液中 短时间（30分钟~6小时）地保存间充质干细胞时，能够抑制细胞存活率降低（专利文献 4)。但是，专利文献4记载的发明中，并未显示通过并用海藻糖与葡聚糖而产生的协同效 果。在为解决上述课题而反复进行深入研究的过程中，本申请的发明人发现，如果在生理性 水溶液中添加海藻糖及葡聚糖使得其成为特定的浓度（分别为2. 0~6. 0 [w/v] %及4. 0~ 7. 0 [w/v] % )，将人骨髓间充质干细胞（hMSC-BM)、人末梢血T细胞（hPBT)保存在该溶液中 时，可以长期（至少14天）协同性地抑制细胞存活率降低，并可以协同性地提高活细胞的 比例，从而完成了本发明。
[0021] 即，本发明涉及：（1)在下述细胞移植用生理性水溶液中保存哺乳动物细胞的方 法，所述细胞移植用生理性水溶液含有2. 0~6. 0(w/v) %的海藻糖或其衍生物或它们的 盐、和4.0~7.0 (w/v) %的葡聚糖或其衍生物或它们的盐；（2)如上述（1)所述的方法，其 特征在于，生理性水溶液选自由乳酸林格液、生理盐水、林格液及乙酸林格液组成的组；（3) 如上述（1)或（2)所述的方法，其特征在于，在细胞移植用生理性水溶液中将哺乳动物细胞 保存3~14天；(4)如上述（1)~（3)中任一项所述的方法，其特征在于，哺乳动物细胞为 哺乳动物间充质干细胞或哺乳动物T细胞；（5)如上述（4)所述的方法，其特征在于，哺乳 动物间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞，哺乳动物T细胞为人末梢血T细胞。
[0022] 本发明还涉及：（6)细胞移植用生理性水溶液，其含有2. 0~6. 0 (w/v) %的海藻糖 或其衍生物或它们的盐、和4. 0~7. 0(w/v) %的葡聚糖或其衍生物或它们的盐；（7)如上 述（6)所述的细胞移植用生理性水溶液，其特征在于，生理性水溶液选自由乳酸林格液、生 理盐水、林格液及乙酸林格液组成的组；（8)如上述（6)或（7)所述的细胞移植用生理性水 溶液，其特征在于，哺乳动物细胞为哺乳动物间充质干细胞或哺乳动物T细胞；(9)如上述 (8)所述的细胞移植用生理性水溶液，其特征在于，哺乳动物间充质干细胞为人骨髓间充质 干细胞，哺乳动物T细胞为人末梢血T细胞。
[0023] 本发明还涉及：（10)含有移植用细胞的生理性水溶液，其含有哺乳动物细胞、和 2. 0~6. 0 (w/v) %的海藻糖或其衍生物或它们的盐、及4. 0~7. 0 (w/v) %的葡聚糖或其衍 生物或它们的盐；（11)如上述（10)所述的含有移植用细胞的生理性水溶液，其特征在于， 生理性水溶液选自由乳酸林格液、生理盐水、林格液及乙酸林格液组成的组；（12)如上述 (10)或（11)所述的含有移植用细胞的生理性水溶液，其特征在于，哺乳动物细胞为哺乳动 物间充质干细胞或哺乳动物T细胞；（13)如上述（12)所述的含有移植用细胞的生理性水 溶液，其特征在于，哺乳动物间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞，哺乳动物T细胞为人末 梢血T细胞。
[0024] 作为本发明的其他实施方式，可以举出：生理性水溶液与海藻糖或其衍生物或它 们的盐和葡聚糖或其衍生物或它们的盐的组合用于保存哺乳动物细胞的应用；生理性水溶 液与海藻糖或其衍生物或它们的盐和葡聚糖或其衍生物或它们的盐的组合用于制备哺乳 动物细胞的移植用溶液的应用，更详细而言，上述海藻糖或其衍生物或它们的盐和葡聚糖 或其衍生物或它们的盐是抑制细胞存活率降低的有效成分。
[0025] 根据本发明，能够抑制长期（至少14天）保存含有间充质干细胞等干细胞、T细 胞等白细胞的细胞悬浮液时的细胞存活率的降低，因此，不仅可以将再生医疗、癌症治疗中 的优质移植用细胞悬浮液供往细胞悬浮液的制造地区或其周边地区，而且也可以将其供往 遥远地区；另外，医药品出货时的品质保证检查包括无菌试验，根据日本药局方的规定，无 菌检查需要14天的时间，而根据本发明，即使在上述细胞悬浮液被制造并被实施了上述无 菌检查之后，也仍能够提供优质的细胞悬浮液。
【附图说明】
[0026] 图1是表示对使用11种哺乳动物细胞移植用溶液（S、LR、"LR+1 % D"、"LR+3% D"、 "LR+5% D"、"LR+7% D"、"LR+3% T"、"LR+3% T+l% D"、"LR+3% T+3% D"、"LR+3% T+5% D"及"LR+3% T+7% D"溶液：参见实施例1的"1-1-1细胞移植用溶液"）将hMSC-BM保存 14天时的细胞存活率进行分析而得的结果的图。纵轴中，以细胞存活率（％)的形式示出 活细胞相对于总细胞数的比例（平均值土标准偏差，η = 4)。需要说明的是，作为对照示 出保存前的Dulbecco磷酸缓冲盐水（D-PBS[-])(以下简称为"PBS"。）溶液中的细胞存活 率（图中横轴的"P"）。
[0027] 图2是表示对使用11种哺乳动物细胞移植用溶液（S、LR、"LR+1 % D"、"LR+3% D"、 "LR+5% D"、"LR+7% D"、"LR+3% T"、"LR+3% T+l% D"、"LR+3% T+3% D"、"LR+3% T+5% D"及"LR+3% T+7% D"溶液[分别为图中横轴的"2~12"]:参见实施例1的"1-1-1细 胞移植用溶液"）将hMSC-BM保存3天、7天及14天时的细胞存活率进行分析而得的结果的 图。纵轴中，以细胞存活率（％)的形式示出活细胞相对于总细胞数的比例（平均值土标 准偏差，η = 4)。需要说明的是，作为对照示出保存前（0天后）的PBS溶液中的细胞存活 率（图中横轴的"1"）。
[0028] 图3是表示对使用13种哺乳动物细胞移植用溶液（S、LR、"LR+1 % T"、"LR+3% Τ"、 "LR+5% T"、"LR+7% T"、"LR+10% T"、"LR+5% D"、"LR+5% D+l% T"、"LR+5% D+3% T"、 "LR+5% D+5% T"、"LR+5% D+7% T"及"LR+5% D+10% T"溶液：参见实施例 2 的"2-1-1 细 胞移植用溶液"）将hMSC-BM保存14天时的细胞存活率进行分析而得的结果的图。纵轴中， 以细胞存活率（％)的形式示出活细胞相对于总细胞数的比例（平均值土标准偏差，η = 4)。需要说明的是，作为对照示出保存前的PBS溶液中的细胞存活率（图中横轴的"Ρ"）。
[0029] 图4是表示对使用11种哺乳动物细胞移植用溶液（S、LR、"LR+1 % T"、"LR+3% T"、 "LR+5% T"、"LR+7% T"、"LR+5% D"、"LR+5% D+l% T"、"LR+5% D+3% T"、"LR+5% D+5% T"及"LR+5% D+7% T"溶液[分别为图中横轴的"2~12"]:参见实施例2的"2-1-1细 胞移植用溶液"）将hMSC-BM保存3天、7天及14天时的细胞存活率进行分析而得的结果的 图。纵轴中，以细胞存活率（％)的形式示出活细胞相对于总细胞数的比例（平均值土标 准偏差，η = 4)。需要说明的是，作为对照示出保存前（0天后）的PBS溶液中的细胞存