用于测量强度的串扰校准的方法和设备的制造方法
【技术领域】
[0001] 本文件公开涉及用于串扰校准在两个或更多个检测波段上从样品测量的强度的 方法。此外，本公开涉及用于串扰校准在两个或更多个检测波段上从样品测量的强度的设 备和计算机程序。此外，本公开涉及提供串扰校准的测量仪器。
【背景技术】
[0002] 在多分析物测定中广泛使用的原理是使用带标记的分析物特定的示踪分子，其中 可以根据可依赖于所使用的一个或多个激发波长的基于荧光的发射信号中发生的改变来 检测样品中分析物的浓度。在理想情况下，与不同分析物相关的基于荧光的发射信号出现 在非重叠的检测波段，因此可以利用简单的光学滤波将发射信号彼此分离。然而，在许多情 况下，与不同分析物相关的基于荧光的发射信号光谱中的一个或多个如此之宽并且在光谱 上重叠，从而不可能选择出如下这种检测波段：使得在这些检测波段上测量的所有的发射 信号无串扰。
[0003] 用于串扰校准的简单的原理适用于双分析物测定，其中，利用合适的时间检测窗 口和/或合适的检测波段，发射信号之一的强度可被无串扰地测量。在仅存在产生第一发 射信号的分析物的测试状态下，利用第一发射信号的测量强度和指示发生在检测波段中的 第一发射信号的强度与发生在检测波段中的另一发射信号的强度之间的关系的经验串扰 参数来校准另一发射信号的测量强度。当使用该方法时，值得注意的是，第一发射信号的测 量强度可能至少部分地由在检测反应中不产生第一发射信号时也存在的背景信号引起。因 此，为了避免太强的串扰校准，特别是在检测反应中不产生第一发射信号或者仅产生少量 的第一发射信号的情况下，应当在串扰校准之前从第一发射信号的测量强度中充分地消除 背景信号的贡献。可以根据从合适的测试样品测量的强度确定背景信号和串扰参数的贡 献。
[0004] 然而，在许多情况下，状况更加复杂，以至于没有发射信号可以被无串扰地测量， 即，发射信号在光谱和时间上重叠，从而不可能选择这种时间检测窗口和/或检测波段以 使得发射信号中至少之一能够被无串扰地测量。出现上述类型的状况的例证情形例如是根 据基于时间分辨荧光共振能量转移"TR-FRET"的多分析物检测的测定。例证性的基于FRET 的检测方法的相关细节可以参照例如公开US20060147954和V. Laitala等人于2007年在 Analytical Biochemistry 第 361 卷 126-131 页发表的"Time-resolved detection probe for homogeneous nucleic acid analyses in one-step format'，。在 V. Laitala 等人所 描述的方法中，每个FRET探针包括供体、受体，以及能够与其互补靶序列特异性杂交的反 应区域，即，通过所考虑探针待检测的靶分析物。在V. Laitala等人所描述的方法中，给定 类型的探针群的时间分辨荧光发射信号包括两种信号成分：第一信号成分，属于由于来自 受激供体的能量转移而被激发的受体；以及第二信号成分，属于不参与能量转移的受激供 体。受体优选地被选择为使得它的发射光谱在一波长处具有最大值而供体在该波长处具有 其发射光谱的局域最小值。能量转移引起的受体发射的衰减时间依赖于能量转移效率，该 效率进而与受体和供体之间的距离成反比。能量转移引起的受体发射的衰减时间在探针未 被杂交时（即供体-受体距离短）明显地快于探针与靶分析物杂交时（即供体-受体距离 较长）。因此，可以利用合适的时间检测窗口将杂交探针的受体发射信号与未杂交探针的受 体发射信号分离。可以利用合适的检测波段将与不同的靶分析物杂交的不同探针的受体发 射信号彼此分离，但是，如上所述，串扰使状况复杂化。不参与能量转移的受激供体引起的 背景发射依赖于所考虑的样品中杂交探针占总探针的百分比的事实使得该状况更加复杂。
【发明内容】
[0005] 为了提供对各个例证性实施例的一些方面的基本理解，下文给出简化的概括说 明。该概括说明并不是对本文件公开的广泛阐述。它既不意于确定例证性实施例的重要或 关键的元件，也不意于划定保护范围。如下的概括说明仅仅以简化的方式呈现一些构思，作 为例证性实施例的更详细描述的前序部分。
[0006] 根据本公开，提供了一种用于串扰校准在两个或更多个检测波段上从待分析样品 测量的强度的方法。每个检测波段与样品所包含的多个分析物特定的探针群中的一个探针 群相关，并且每个探针群在激发之后能够发射第一信号成分和第二信号成分，第一信号成 分和第二信号成分的光谱彼此不同并且至少第一信号成分依赖于能够由所述探针群检测 的分析物的存在。在该文件中，词语"样品"意指包含一种或多种待检测分析物和检测所需 的测定试剂的物质，所述测定试剂包含上述多个探针群。
[0007] 所述方法包括：
[0008] -基于a)第一串扰参数和b)表示发生在检测波段之外的至少一个辅助波段上并 且至少部分地由第二信号成分引起的至少一个强度的至少一个值，计算发生在检测波段上 并且至少部分地由探针群发射的第二信号成分引起的串扰强度的估计值，以及
[0009] -基于a)在检测波段上测量的强度、b)计算出的串扰强度的估计值和c)第二串 扰参数来计算检测波段的串扰校准强度，
[0010] 其中：
[0011] -第一串扰参数中的每一个表示a)发生在一个检测波段上并且至少部分地由第 二信号成分引起的强度和b)发生在辅助波段上并且至少部分地由第二信号成分引起的强 度之间的关系，以及
[0012] -第二串扰参数中的每一个表示a)发生在与一个探针群相关的检测波段上并且 至少部分地由另一个探针群发射的第一信号成分引起的强度和b)发生在与所述另一个探 针群相关的检测波段上并且至少部分地由所述另一个探针群发射的第一信号成分引起的 强度之间的关系。
[0013] 探针群可以是，例如但非必须地，基于荧光共振能量转移"FRET"的探针的群。用 于串扰校准的方法例如可以与适合于诸如重症综合性免疫缺陷"SCID"测定的基于时间分 辨荧光共振能量转移"TR-FRET"的多分析物检测结合使用。
[0014] 在根据一个有益的但是非限制性的实施例的方法中，表示发生在辅助波段上并且 至少部分地由第二信号成分引起的强度的值具有在辅助波段上从样品测量的值。因此，例 如与基于FRET的测定结合，背景发射对杂交探针占总探针的百分比的依赖性可被考虑到 串扰校准中。在一种情况下，当在包含样品的微量滴定池中实施测定时，发生在辅助波段上 并且至少部分地由第二信号成分引起的强度优选地分别从每个样品池测量。
[0015] 根据本公开，还提供了一种用于串扰校准在两个或更多个检测波段上从待分析样 品测量的强度的设备。每个检测波段与样品所包含的多个分析物特定的探针群中的一个探 针群相关，并且每个探针群在激发之后能够发射第一信号成分和第二信号成分，第一信号 成分和第二信号成分的光谱彼此不同并且至少第一信号成分依赖于能够由所述探针群检 测的分析物的存在。所述设备包括计算系统，计算系统被配置为：
[0016] -基于a)第一串扰参数和b)表示发生在检测波段之外的至少一个辅助波段上并 且至少部分地由第二信号成分引起的至少一个强度的至少一个值，计算发生在检测波段上 并且至少部分地由探针群发射的第二信号成分引起的串扰强度的估计值，以及
[0017] -基于a)在检测波段上测量的强度、b)计算出的串扰强度的估计值和c)第二串 扰参数来计算检测波段的串扰校准强度，
[0018] 其中：
[0019] -第一串扰参数中的每一个表示a)发生在一个检测波段上并且至少部分地由第 二信号成分引起的强度和b)发生在辅助波段上并且至少部分地由第二信号成分引起的强 度之间的关系，以及
[0020] -第二串扰参数中的每一个表示a)发生在与一个探针群相关的检测波段上并且 至少部分地由另一个探针群发射的第一信号成分引起的强度和b)发生在与所述另一个探 针群相关的检测波段上并且至少部分地由所述另一个探针群发射的第一信号成分引起的 强度之间的关系。
[0021] 根据本公开，还提供了一种仪器，包括：
[0022] -用于在两个或更多个检测波段上从待分析样品测量强度的测量装置，以及
[0023] -根据本公开的用于串扰校准在两个或更多个检测波段上从样品测量的强度的设 备。
[0024] 根据本公开，还提供了一种用于串扰校准在两个或更多个检测波段上从待分析样 品测量的强度的计算机程序。该计算机程序包括计算机可执行指令，所述指令用于控制可 编程处理器：
[0025] -基于a)第一串扰参数和b)表示发生在检测波段之外的至少一个辅助波段上并 且至少部分地由第二信号成分引起的至少一个强度的至少一个值，计算发生在检测波段上 并且至少部分地由探针群发射的第二信号成分引起的串扰强度的估计值，以及
[0026] -基于a)在检测波段上测量的强度、b)计算出的串扰强度的估计值和c)第二串 扰参数来计算检测波段的串扰校准强度，
[0027] 其中：
[0028] -第一串扰参数中的每一个表示a)发生在一个检测波段上并且至少部分地由第 二信号成分引起的强度和b)发生在辅助波段上并且至少部分地由第二信号成分引起的强 度之间的关系，以及
[0029]