一种人类免疫缺陷病毒Vpr蛋白的制备方法

文档序号:9574212阅读:1463来源:国知局
一种人类免疫缺陷病毒Vpr蛋白的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域,具体涉及一种人类免疫缺陷病毒Vpr蛋白的制备方法。
[0002]
【背景技术】
[0003]人类免疫缺陷病毒1 型(human immunodeficiency virus type 1,HIV_1)感染导致的获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)是在全球广泛流行的严重疾病。HIV-1基因组包含(编码基质蛋白、衣壳蛋白和核衣壳蛋白等)、pol (编码蛋白酶、反转录酶和整合酶等)、env (编码包膜蛋白gpl20和gp41等)三种结构基因,以及 tat、rev、nef、vpr、vpu.、Ki/六种调节 / 辅助基因[1] ([1] Frankel AD,Young JA.HIV-1: fifteen proteins and an RNA[J].Annual review of b1chemistry.1998,67:1-25.),这些基因各自以不同的方式调节着HIV-1的生物学功能。
[0004]病毒蛋白R (viral protein R,Vpr)是由96个氨基酸组成、分子量大小约为14kD的辅助蛋白,通过与Gag蛋白p6区域直接作用而包装于HIV-1病毒颗粒[2]( [2] MullerB, Tessmer U, Schubert U, Krausslich HG.Human immunodeficiency virus type 1Vpr protein is incorporated into the vir1n in significantly smaller amountsthan gag and is phosphorylated in infected cells [J].Journal of virology.2000, 74(20):9727-31.)D Vpr在HIV-1病毒复制与致病过程中发挥着重要作用,如促进整合前复合体的核运输[3] ([3] Vodicka MA, Koepp DM, Silver PA, Emerman M.HIV-1 Vpr interacts with the nuclear transport pathway to promote macrophageinfect1n[J].Genes & development.1998,12 (2): 175—85.)、加强逆转录过程的保真度⑷([4] Rogel ME, ffu LI, Emerman M.The human immunodeficiency virus type 1vpr gene prevents cell proliferat1n during chronic infect1n[J].Journal ofvirology.1995,69⑵:882-8.)、诱导细胞周期阻滞于G2/M期从而抑制细胞增殖[5] ([5]Andersen JL, Le Rouzic E, Planelles V.HIV-1 Vpr: mechanisms of G2 arrest andapoptosis[J].Experimental and molecular pathology.2008,85(1):2-10.)、反式激活HIV-1长末端重复序列以诱导病毒基因转录和翻译等([6] Wang L,MukherjeeS,Jia F,Narayan 0,Zhao LJ.1nteract1n of vir1n protein Vpr of humanimmunodeficiency virus type 1 with cellular transcript1n factor Spl andtrans-activat1n of viral long terminal repeat[J].The Journal of b1logicalchemistry.1995,270(43):25564-9.)。目前研究发现,Vpr 蛋白在 HIV-1 感染细胞的胞楽与胞核中均有表达[7 8] ([7] Jacquot G,Le Rouzic E,David A,MazzoliniJ,Bouchet J,Bouaziz S, et al.Localizat1n of HIV-1 Vpr to the nuclearenvelope:1mpact on Vpr funct1ns and virus replicat1n in macrophages[J].Retrovirology.2007,4:84.[8] Subbramanian RA, Kessous-Elbaz A, Lodge R, ForgetJ,Yao XJ, Bergeron D,et al.Human immunodeficiency virus type 1 Vpr is apositive regulator of viral transcript1n and infectivity in primary humanmacrophages[J].The Journal of experimental medicine.1998,187 (7):1103-11.);更为重要的是,Vpr蛋白可以释放入AIDS患者的血清和脑脊液中,并被多种细胞所摄取[9 10] ([9] Levy DN,Refaeli Y,MacGregor RR,Weiner DB.Serum Vpr regulatesproductive infect1n and latency of human immunodeficiency virus type 1 [J].Proceedings of the Nat1nal Academy of Sciences of the United States ofAmerica.1994,91 (23): 10873-7.[10] Levy DN, Refaeli Y,Weiner DB.ExtracellularVpr protein increases cellular permissiveness to human immunodeficiency virusreplicat1n and reactivates virus from latency [J].Journal of virology.1995,69(2):1243-52.)。在 AIDS 患者血清中,Vpr 浓度约为 1-10 ng/mL[11] ([11] HoshinoS,Sun B,Konishi M,Shimura M,Segawa T,Hagiwara Y,et al.Vpr in plasma ofHIV type 1-positive patients is correlated with the HIV type 1 RNA titers[J].AIDS research and human retroviruses.2007,23 (3): 391-7.)D 因此 Vpr 蛋白在 HIV-1感染过程中起到的重要作用可通过多种机制实现,其中存在于体液中的Vpr蛋白能够进入并破坏未感染的细胞,并诱导正常细胞的凋亡,可作为应用于肿瘤基因治疗的潜在蛋白。
[0005]既往对于Vpr的研究通常以完整病毒感染作为模型,但基于生物安全性方面的考虑,研究者们现在更倾向于通过单独表达的胞外Vpr蛋白来研究其生理作用。例如从患者血清和脑脊液中纯化得到具有功能的Vpr蛋白,并且纯化所得的Vpr蛋白在CD4+ T细胞和神经元细胞中分别具有反式激活和细胞毒作用[9]。但从AIDS患者血清和脑脊液中获得Vpr蛋白的方法存在以下不足:一是在操作过程中仍然存在安全隐患;二是制备方法的复杂性;三是获得的Vpr蛋白纯度不够理想,抗原性不强。本发明提供的利用原核表达系统获得的HIV-1 Vpr重组蛋白纯度较高,具有抗原性,能够以可溶性蛋白的形式被B淋巴细胞和内皮细胞所摄取,进入细胞后可发挥诱导细胞凋亡的功能,并且制备过程相对安全简单,能够用于Vpr抗体的检测,对于研究HIV-1的致病机制和检测方法具有重要的理论和临床意义。
[0006]

【发明内容】

[0007]发明目的:本发明提供一种人类免疫缺陷病毒Vpr蛋白的制备方法,根据HIV-1 Vpr基因构建重组原核表达质粒pColdll-Vpr,使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β -D-l-th1galactopyranoside,IPTG)在大肠杆菌中诱导重组蛋白表达,并通过镍柱亲和层析法进行纯化,制备人类免疫缺陷病毒Vpr蛋白。
[0008]本发明的技术方案:
一种人类免疫缺陷病毒Vpr蛋白的制备方法,包括如下步骤:以SEQ ID No:3~4为引物,GenBank登录号NC_001802的序列为模板,进行PCR扩增,获得目的基因;用限制性内切酶Nde I和Xba I对PCR产物和pColdll载体进行酶切、纯化、连接,转化至大肠杆菌,培养后用诱导物诱导表达,经超声破碎后对蛋白质进行分离纯化。
[0009]所述PCR 扩增条件为:95°C预变性 5 min,然后 95°C 1 min,62°C 1 min,72°C 1min条件下扩增30个循环,最后72°C延伸7 min。
[0010]所述PCR产物与pColdll载体的体积比为7:1。
[0011]所述诱导物为异丙基-β -D-硫代半乳糖苷。
[0012]人类免疫缺陷病毒Vpr蛋白在检测人类免疫缺陷病毒Vpr抗体中的应用。
[0013]有益效果:
(1)本发明根据Hiv-l Vpr基因序列制备重组蛋白,获得的重组蛋白纯度高、特异性较好、产量丰富。
[0014](2)本发明可以应用于HIV-1 Vpr抗体检测,以及可溶性Vpr蛋白的功能研究。
【附图说明】
[0015]图1 为 HIV-1 Vpr 基因的 PCR 扩增。其中 M:Lammda DNA Marker ;1:以质粒pC1-neo-Vpr为模板的PCR扩增产物。
[0016]图2为重组原核表达质粒pColdll-Vpr的双酶切鉴定。M:Lammda DNA Marker ;1:未酶切的pColdll-Vpr质粒;2: pColdll-Vpr质粒的PCR鉴定;3:pColdII_Vpr质粒双酶切后。
[0017]图3为不同浓度IPTG诱导Vpr蛋白的表达情况。Μ:蛋白标准参照物;1:未使用IPTG诱导;2:浓度为0.4 mM的IPTG诱导;3:浓度为0.6 mM的IPTG诱导;4:浓度为0.8mM的IP
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