一种丙型肝炎病毒重组蛋白的制备及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种丙型肝炎病毒重组蛋白的 制备及其应用。
【背景技术】
[0002] 丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus,HCV)感染是导致人类肝硬化、肝癌的主要诱 因之一，在世界范围内有约170, 000, 000人感染，感染率高达3%，极大威胁着人类的健康。 目前对于丙型肝炎病毒，尚无预防性或治疗性疫苗可用。
[0003] 随着临床研究的深入，越来越多的证据表明中和抗体在HCV感染的控制、清除过 程中起着重要的作用。在病人体内，中和抗体的快速诱导，中和抗体的滴度、广度与HCV感 染的清除直接相关。无论黑猩猩实验还是病人临床样本分析均显示，在HCV急性感染过程 中，快速诱导出的中和抗体可以有效控制和清除HCV感染；而在慢性感染病人体内，如果 在感染早期没有诱导出高滴度中和抗体，即便晚期体内诱导出中和抗体，也无法控制病毒 的持续感染。因此，诱导高滴度的中和抗体反应是早期HCV疫苗研发的一个重要指标。然 而，由于HCV本身的高度变异性、血清中脂蛋白成分的包裹、糖基化对中和位点的掩护以及 干扰抗体的作用等原因，早期HCV候选疫苗所产生的抗体往往只对相同亚型病毒有中和效 果，不具有广谱性。
[0004] 因此，本领域迫切需要开发能够诱导针对所有或大多数亚型病毒的广谱中和抗 体，以便用于开发HCV预防性疫苗。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种丙型肝炎病毒重组蛋白的制备及其应用。
[0006] 本发明的第一方面，提供了一种分离的HCV抗原肽，所述抗原肽源自HCV病毒的E2 蛋白（尤其是E2蛋白的胞外区），并且所述抗原肽的长度为200-350个氨基酸，并且所述抗 原肽可结合于抗HCV的抗体。
[0007] 在另一优选例中，所述HCV病毒为HCVlb型病毒；优选地，为Coni毒株。
[0008] 在另一优选例中，所述的抗原肽具有诱导广谱中和抗体的能力，所述广谱中和抗 体可结合于选自下组的至少6种或全部HCV毒株：Coni,PR52,PR79L9,JFH1，S52,HK6a，H77/ JFH1,Conl/JFHl,J6/JFH1,PR26,PR79L9,J8/JFH1,S52/JFH1,ED43/JFH1,PR26C3mt,SA13/ JFH1,HK6a/JFHl和QC69/JFH1。
[0009] 在另一优选例中，所述的抗原肽与受体SR-BI的结合活性A1与相应野生型E2蛋 白与受体SR-ΒΙ的结合活性的B1的比值A1/B1彡0. 7,较佳地彡0. 5,更佳地彡0. 2。
[0010] 在另一优选例中，所述的抗原肽选自下组：
[0011] ⑷具有SEQIDN0:5、SEQIDN0. :3、SEQIDN0. :4 或SEQIDN0. :2 所示氨基 酸序列的多肽；
[0012] (B)具有㈧中任一所示氨基酸序列彡80%同源性（优选地，彡90%的同源性； 等优选地彡95 %的同源性；最优选地，彡97 %的同源性）的多肽，且所述多肽具有与抗HCV的抗体的结合能力；
[0013] (C)将SEQIDN0:2-5中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失 或添加而形成的，且保留与抗HCV抗体结合能力的衍生多肽。
[0014] 在另一优选例中，所述的抗HCV抗体包括抗HCV野生型E2蛋白抗体，其中包括抗 血清、或抗HCV野生型E2蛋白的对应区域的单克隆抗体。
[0015] 在另一优选例中，所述的抗原肽选自下组：SEQIDN0:5、SEQIDN0. :3、SEQID NO. : 4、SEQIDNO. :2 或其组合。
[0016] 在另一优选例中，所述抗原肽采用化学合成或生物工程方法获得，包括重组蛋白、 融合蛋白。
[0017] 在另一优选例中，所述的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体或抗血清。
[0018] 在另一优选例中，所述的E2蛋白包括野生型和突变型的E2序列。
[0019] 本发明的第二方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白含有本发明第一方面所 述的抗原肽和任选的标签序列和/或连接序列。
[0020] 在另一优选例中，所述标签序列为6His序列。
[0021] 本发明的第三方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第 一方面所述的抗原肽或本发明第二方面所述的融合蛋白。
[0022] 在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：
[0023] (a)编码如SEQIDN0. : 2-5所示多肽的多核苷酸；
[0024] (b)序列如SEQIDNO. :9、SEQIDNO. :8、SEQIDN0. :7 或SEQIDN0. :6 所示的 多核苷酸；
[0025] (c)核苷酸序列与（b)所示序列的同源性彡95% (较佳地彡98% )的多核苷酸；
[0026] (d)如（b)所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个（较佳地1-30， 更佳地卜1〇个）核苷酸的多核苷酸；
[0027] (e)与（a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
[0028] 本发明的第四方面，提供了 一种表达载体，所述表达载体含有本发明第三方面所 述的多核苷酸。
[0029] 本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第四方面 所述的表达载体，或者在基因组中整合有本发明第三方面所述的多核苷酸。
[0030] 在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。
[0031] 在另一优选例中，所述的宿主细胞包括果蝇S2细胞、大肠杆菌、酵母、CH0细胞、DC 细胞等。
[0032] 本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有本发明第一 方面所述的抗原肽、本发明第二方面所述的融合蛋白、本发明第三方面所述的多核苷酸、本 发明第四方面所述的表达载体或者本发明第五方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的 载体和/或辅料。
[0033] 在另一优选例中，所述的药物组合物为疫苗。
[0034] 本发明的第七方面，提供了一种疫苗组合物，所述的疫苗组合物含有本发明第一 方面所述的抗原肽、本发明第二方面所述的融合蛋白、本发明第三方面所述的多核苷酸、本 发明第四方面所述的表达载体或者本发明第五方面所述的宿主细胞，以及免疫学上可接受 的载体和/或辅料。
[0035] 在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。
[0036] 在另一优选例中，所述的佐剂包括氧化铝、皂苷、quilA、胞壁酰二肽、矿物油或 植物油、基于囊泡的佐剂、非离子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、细胞因子（包括IL-1、IL-2、 IFN-r、GM-CSF、IL-6、IL-12 和CpG)。
[0037] 在另一优选例中，所述佐剂选自：铝佐剂、铝佐剂混合CpG、和弗氏佐剂。
[0038] 本发明的第八方面，提供了本发明第一方面所述的抗原肽、本发明第二方面所述 的融合蛋白、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的表达载体或者本发 明第五方面所述的宿主细胞的用途，
[0039] (a)用于制备针对所述抗原肽的抗体；和/或
[0040] (b)用于制备治疗或预防HCV感染相关疾病的药物；和/或
[0041] (c)用于制备检测HCV的试剂或试剂盒；和/或
[0042] (d)用于检测抗HCV的抗体。
[0043] 在另一优选例中，所述的"检测HCV的试剂或试剂盒"包括检测片、检测板、蛋白芯 片、液基芯片、磁珠。
[0044] 在另一优选例中，所述抗HCV抗体为人体液样品中的抗HCV抗体。优选地，所述体 液是血液或唾液。
[0045] 本发明的第九方面，提供了一种免疫检测试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方 面所述的用于检测抗HCV抗体的抗原肽。
[0046] 在另一优选例中，所述试剂盒中可以包括一种或多种本发明第一方面所述的用于 检测抗HCV抗体的抗原肽。
[0047] 在另一优选例中，所述试剂盒还包括载体，所述的抗原肽包被在所述载体上。
[0048] 在另一优选例中，所述免疫检测试剂盒还包括标记的抗HCV抗体的二抗。二抗用 来检测人血清中的抗体IgG，IgM，或IgA.所用标记物可以是辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶， 荧光分子FITC(或其它荧光标记），化学发光检测。检测方法可以是显色法，荧光方法，化学 发光，电化学发光法进行定性、定量分析。
[0049] 在另一优选例中，所述的二抗是辣根过氧化物酶标记的二抗。
[0050] 本发明的第十方面，提供了一种本发明第一方面所述的抗原肽的制备方法，包括 以下步骤：
[0051] (a)培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达出本发明第一方面所述的抗 原肽；
[0052] (b)分离所述的抗原肽。
[0053] 在另一优选例中，所述的宿主细胞为果蝇S2细胞。
[0054] 在另一优选例中，在步骤（a)之前，所述方法还包括以下步骤：
[0055] (1)提供一编码HCVE2蛋白的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列如SEQID NO. : 6-9 所示；
[0056] (2)制备含有步骤⑴中所述多核苷酸序列的载体；
[0057] (3)将步骤（2)中的载体导入宿主细胞，从而制得权利要求4所述的宿主细胞。
[0058] 在另一优选例中，所述载体为诱导型表达载体。
[0059] 在另一优选例中，所述载体为pcDNA3. 1 (+)质粒。
[0060] 在另一优选例中，在所述步骤（a)中，当所述宿主细胞中导入的载体为诱导型表 达载体时，在细胞密度彡IXl〇7/ml后再添加诱导剂。
[0061] 本发明的第十一方面，提供了一种治疗方法，给需要的对象施用本发明第一方面 所述的抗原肽、本发明第二方面所述的融合蛋白、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明 第四方面所述的表达载体或者本发明第五方面所述的宿主细胞、本发明第六方面所述的的 药物组合物或本发明第七方面所述的疫苗组合物。
[0062] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0063] 图1显示了sE2蛋白在S2细胞上清中的表达、鉴定与纯化。（A)S2细胞sE2表达 质粒pMT-Bip/SE2/His示意图。（B)sE2原始编码基因（WT)与密码子优化后的编码基因 (0ΡΤΙ)克隆到上述载体上后，用磷酸钙法瞬时转染S2细胞。优化过的序列能够更加高效地 表达sE2。（C)氯化铬诱导后分别于第0, 3, 5, 7, 9天收取细胞上清，Westernblot检测sE2 蛋白的表达情况，一抗为1:1000稀释的鼠抗His单抗（abmart)，二抗为1:4000稀释的HRP 标记的山羊抗鼠IgG。（D)SDS-PAGE胶考马斯亮蓝染色分析镍柱纯化后的sE2蛋白，大小约 46kDa。
[0064] 图2显示了sE2蛋白的特性分析。⑷未经PNGase处理和经过PNGase酶切的sE2 蛋白在SDS-PAGE胶电泳后Westernblot检测，分别用1:1000稀释的鼠His单抗（abmart) 和1:1000稀释的鼠E2单抗（AP33)作为一抗，1:4000稀释的AP标记的山羊抗鼠IgG作为 二抗。（B)分别用识别构象表位的单抗E2C1和识别线性表位的单抗AP33对sE2进行ELISA 检测，以检验其抗原性。a-Core单抗为阴性对照。（C)sE2与野生型CH0细胞的结合情况。 (D)sE2与稳定表达HCV受体的细胞系CH0-⑶81的结合情况，约76. 2%的细胞能与sE2结 合。（E)sE2与稳定表达HCV受体的细胞系CH0-SRB1的结合情况，约64. 5%的细胞能与sE2 结合。（F)sE2可竞争性抑制HCV感染Huh7. 5. 1细胞。将不同浓度的sE2或BSA与Huh7. 5. 1 细胞37°C孵育1小时，而后加入HCVConl/JFH-1病毒进行感染，72h后进行HCVNS3蛋白 的免疫荧光染色，在荧光显微镜（Leica)下对每孔的荧光斑点数进行计数。以Oyg/mL的 荧光斑点数为空白对照组，感染抑制效果（％) =(空白对照组的荧光斑点数-相应孔中的 荧光斑点数）/空白对照组的荧光斑点数*100%。
[0065] 图3显示了sE2可特异性检测HCV感染病人血浆。sE2包被的ELISA板，分别用 1:2000或1:20000稀释的健康人血浆和丙肝病人血浆进行孵育，随后孵育二抗、显色，中止 显色后读取0D450。在1:20000稀释时的病人血清也能显示将近1. 0的读值。
[0066] 图4显示了sE2蛋白可在BALB/c小鼠诱导良好的体液免疫反应。⑷免疫实验 分组。sE2分别以铝佐剂（Alum)、铝佐剂+CpG、或弗氏佐剂（FA)为佐剂，并设PBS对照组。 (B)分别于第0, 2, 4周腹腔注射免疫BALB/c小鼠，分别于第0, 4, 6, 13, 17, 22, 25周取血， 用ELISA的方法检测血清中针对sE2特异性抗体的终端滴度。为检测免疫记忆，于第25周 进行一次加免，并在第27周取血检测血清中特异性抗体的终端滴度。三个免疫组小鼠加强 免疫后的抗体终端滴度达到1〇5_1〇6。
[0067] 图5显示了sE2免疫后在兔体内诱导出的特异性高抗体的滴度随时间变化情况。 用弗氏佐剂与sE2混合免疫新西兰兔，免疫间隔为两周，每隔2周采血。三免后三周处死， 收集血清。免疫后的抗体终端滴度达到1〇 6-1〇7。
[0068] 图6显示了sE2免疫小鼠血清能够中和1-7型的HCV病毒。（A)sE2分别以铝佐 剂、铝佐剂+CpG、或弗氏佐剂为佐剂，腹腔注射免疫小鼠。小鼠第27周的抗血清1:40稀释 后进行体外中和实验，确定对所有7个亚型的13株不同HCV病毒的中和效果。（B)每组10 只小鼠的抗血清等体积混合后，对每株病毒中和50%的最高稀释度。中和效果（％) =(免 疫前血清组的突光斑点数-相应孔