一种防治苹果树腐烂病的菌株，微生物菌剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种菌株，微生物菌剂及其制备方法，具体设及一种防治苹果树腐烂 病的菌株，微生物菌剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 苹果树腐烂病（Valsacankerofapple)为一区域性病害，主要发生在我国、日本 和朝鲜，在美国、加拿大、英国和俄罗斯等国零星分布。历史上我国先后有5次腐烂病大流 行，给各个时期的苹果产业造成了毁灭性打击。自20世纪50年代W来，先后采用保护性化 学杀菌剂全园喷洒，预防发病，W及对苹果树患病部位采取手术刮治、涂抹內吸治疗性杀菌 剂，杀菌治病的方法，均未能取得预期的效果。
[0003] 近年来，苹果腐烂病的防治，仍W化学药剂为主要防治方式，但是由于苹果腐烂 病菌在树体内的潜伏侵染特性，使化学农药无法解决老瘤的复发问题，使得该病年复一年， 至今无法有效控制；同时，由于化学农药的药效期较短，使用次数和使用剂量在不断加大， 已对果品安全和环境安全构成了巨大的威胁，直接影响着我国在国际上的苹果贸易。因此， 采用生物防治无害化技术，生产高档优质绿色或有机果品，已日益成为人们追求的时尚。
[0004] 目前，生物防治苹果腐烂病的方法主要包括中草药提取物防治、生防真菌防治和 利用农用抗生素防治。例如，段泽敏，王贤萍，周柏玲等.苹果树腐烂病无公害防治技术研 究[J]，山西农业科学，2002, 30(4) : 55~59中公开茵陈、苦参和黄琴等多味中药用于腐烂 病的防治，但中药成分复杂，提取过程繁琐，生产成本高，因此，难W广泛应用。焦荣斌.防 治苹果腐烂病的新药一抗生素S- 921 [J]，河北农业科技，1988, 3:15中公开农用抗生素 S- 921对苹果腐烂病病斑有很好的治疗效果，但不能解决老瘤的复发问题。茹振川，王桂 荣，魏建梅等.木霉菌对苹果树腐烂病菌的抑制作用[J]，河北果树，1999,4:12~13中利 用木霉作为生防菌防治苹果腐烂病，但受环境影响大，难W在田间长期定殖，而且至今未见 在苹果生产中应用。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种防治苹果树腐烂病的微生物菌剂及其制 备方法。
[0006] 本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种防治苹果树腐烂病的球毛壳菌 (化aetomiumglobosum)菌株61239,已于2015年7月1日保藏于中国典型培养物保藏中 屯、，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCCM2015420,保藏地址：中国武汉武汉大学，中国典型 培养物保藏中屯、，邮编：430072。
[0007] 该菌株分离自陕西省白水县苹果园的苹果树翅皮中，该菌的分类地位为真菌界、 子囊菌口、粪壳菌纲、粪壳目、毛壳科、毛壳属，在CMA培养基上菌落呈灰白色，气生菌丝灰 白色。子囊果表生，球形或楠圆形，有孔口，顶生附属丝茂密，不分枝，直或弯曲，波浪状。子 囊棍棒状，簇生，含8个子囊抱子，具柄，易消解。子囊抱子褐色，巧樣形，厚壁，两侧平滑，两 端突起，大小为7. 5-8. 75X8. 75-12. 5μm，有一顶生萌发孔。经形态学特征、培养习性W及rDNA-ITS序列分析鉴定，菌株61239属于球毛壳菌Qiaetomiumglobosum。
[0008] 本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种防治苹果树腐烂病的微生 物菌剂，将球毛壳菌化aetomiumglobosum菌株61239经固体发酵得到发酵物，阴干或在 20~40°C烘干，粉碎，然后与湿润剂、发泡剂、分散剂和填料混合，制成可湿性菌剂，可兑水 喷雾，也可制成涂抹剂。
[0009] 进一步，所述湿润剂为二异下基糞横酸钢，例如拉开粉bx;所述发泡剂为十二烧 基硫酸钢；所述分散剂为木质素横酸巧；所述填料为娃藻±。
[0010] 本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种防治苹果树腐烂病的微生 物菌剂的制备方法，包括W下步骤：
[0011] (1) 一级种子培养：将权利要求1所述的球毛壳菌株61239斜面抱子接到已灭菌 好一级种子培养基中，在培养溫度32~36°C，通气量1 :0. 4~0.8v/v/min并揽拌的条件 下培养45~60虹；
[0012] (2)二级种子培养：按接种量5~15%接入到灭菌好的二级种子培养基中，在培养 溫度32~36°C，通气量1 :0.8~1. 2v/v/min并揽拌的条件下培养20~30虹，得到二级种 子；
[0013] (3)固体发酵培养：在灭菌后冷却至25~30°C的固体发酵培养基中按4~6% 比例接入二级种子，混合后放入固体发酵罐内培养，整个发酵过程分为Ξ个阶段，第一阶段 (0~2地）：0~1化静止培养，物料升溫后间断通风降溫使物料溫度控制在25~30°C;12~ 2地第一次翻曲，并将溫度控制在25°C~28°C;第二阶段（24~10化）：24~3化第二次翻 曲，并将溫度控制在26°C~27°C;之后每1化翻曲一次，并间隔一次补加无菌水lOOKg，将溫 度控制在25°C~27°C;第Ξ阶段（lOOhW后）：10化后不再补水，保持溫度控制在26°C~ 28°C，直至发酵结束，得到含有球毛壳菌株61239的发酵液；
[0014] (4)微生物菌剂的制备：将发酵物阴干或在在20~40°C烘干，粉碎过90~120目， 然后与湿润剂、发泡剂、分散剂和填料混合，制成可湿性菌剂。
[0015] 进一步，步骤（1)中，所述一级种子培养基是由500mlΞ角瓶加入50g大麦和40g 水，pH自然，揽拌均匀后，在121°C灭菌40min制成。
[0016] 进一步，步骤（2)中，二级种子培养基是由5Kg大麦和4Kg水，拌匀后，在12rC灭 菌40min，冷却后接入50g-级种子，平均装入4个曲盘，置于28°C±1曲房中培养5天， 期间补加无菌水1~2次，每间隔1天翻曲一次制成。
[0017] 进一步，步骤（3)中，所述固体发酵培养基是在6m3蒸煮锅内加入500Kg玉米粉和 500Kg过60目玉米賴杆粉，5KgKH2PO4和550Kg水，揽拌均匀后，直接蒸汽加热至m°C，保 溫40min后冷却至28°C制成。
[0018] 本发明筛选的球毛壳菌株61239对苹果腐烂病菌具有显著的抑菌和杀菌活性，特 别是能W苹果树体上的老翅皮、各个剪银口处死组织上的纤维素和木质素为养分，长期定 殖存活于苹果树上，既能预防新病斑的产生，又能防止原有老瘤的复发，可持久地控制苹果 腐烂病菌，从而达到彻底控制和根治苹果腐烂病的目的。
[0019] 本发明生防真菌来源于自然界中，无污染、无公害、无残留，对人畜无毒副作用，无 论是对苹果树还是对人体、生态环境都相当的安全，可运用于苹果树的任何生育期，特别是 休眠期，不产生任何抗性。
[0020] 实验证明，本发明之球毛壳菌株61239对苹果树腐烂病菌特异性强，控制效果好， 平均防效在99. 34%。
【附图说明】
[0021] 图1为球毛壳61239对苹果树腐烂病菌的括抗效果。
[0022] 图2为球毛壳61239对苹果树腐烂病菌的离体防治效果。
[0023] 图3为涂抹球毛壳菌剂的腐烂病瘤处老翅皮保湿结果。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合实施例对本发明进一步加W说明。
[00巧]实施例1:防治苹果树腐烂病的球毛壳菌的分离、纯化、鉴定
[0026] 1、分离、纯化
[0027] 分离自陕西省白水县苹果园的苹果树翅皮中。取苹果树翅皮干样5g，剪成1cm左 右小段，装入1000mlΞ角瓶中，向内加入特制消毒液10ml，振摇6-8min。再加入无菌水 600ml，吸取此悬浮液2ml涂布于马下培养基平面，倾去水液，用綴子夹出翅皮于无菌培养 皿中，剪成小段一并放入马下培养基平面，28°C培养。
[0028] 待分离培养基上长出明显可辨的毛壳菌子囊果后，在解剖镜下挑取单个子囊果， 接种于水琼脂培养基或PDA培养基中进行培养纯化。
[0029] 2、分离鉴定
[0030] (1)形态特征
[0031] 在CMA培养基上菌落呈灰白色，气生菌丝灰白色。子囊果表生，球形或楠圆 形，有孔口，顶生附属丝茂密，不分枝，直或弯曲，波浪状。子囊棍棒状，簇生，含8个 子囊抱子，具柄，易消解。子囊抱子褐色，巧樣形，厚壁，两侧平滑，两端突起，大小为 7. 5-8. 75X8. 75-12. 5μm，有一顶生萌发孔.
[0032] (2)分子生物学鉴定 阳03引挑取在PDA上培养6d的真菌61239的菌丝，采用CTAB法提取其基因 组DNA。利用真菌的通用引物口Sl-F(5' -CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和 ITS4(5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）对真菌 61239rDNA-ITS序列进行PCR扩增，扩增产 物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。PCR扩增和测序结果，获得了长度为 563bp的DNA序列。测序结果在GenBank中进行BLAST比对，结果显示真菌61239和球毛壳 Qiaetomiumglobosum的同源性高达100%。利用化BayesV.3. 1. 2软件构建不同毛壳菌 的ITS序列系统发育树，结果显示真菌61239和球毛壳化aetomiumglobos