一种通过增大细菌体积而增加微生物胞内内含物积累量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种通过增大细菌体积而增加微生物胞内内 含物积累量的方法，内含物包括聚3居基了酸醋（P皿)、蛋白质、聚磯酸和碳小体等。
【背景技术】
[0002] 微生物合成的许多内含物有实际应用，比如内含物聚3居基了酸醋（P皿）可W作 为生物塑料或者医用植入材料、蛋白质内含物可W是有应用价值的酶或者治疗性的多肤、 聚磯酸内含物可W用于提取磯元素作为化肥的成份，碳小体内含物有固定二氧化碳的作用 等。但是，微生物个体的狭小空间障碍了人们大量地获得送种微生物内含物。
[0003] 目前已知的微生物细胞分裂基因主要有；ftsZ、ftsA、ftsQ、sulA、minCD。
[0004] 微生物细胞壁合成相关基因：盘尼西林结合蛋白（PBPs)基因家族皿cA、mrcB、 pbpC、dacB、dacA、dacC、pbpG、dacD、ampC、ampH,异戊二帰isoprene合成必需基因 yluB，yacM，y油H，yacN，和yq巧，肤聚糖合成和修饰基因csbB，自溶素表达的调控基因 lytRo
[0005] 结合过表达支撑细胞的骨架基因；11^613、11^6〔、11^6〇、;1^31、1'〇(12、11^(14、1111'地、1]1131。
[0006] 对上述基因的单独或结合敲除和过表达都会引起微生物细胞的形态变化，主要是 引起细胞体积的变大。
[0007] 比如，化eB是很多原核生物中起骨架作用的蛋白，敲除后细胞会变成圆形，在大肠 杆菌中敲除mreB基因后，大肠杆菌从杆状变成圆形；在此基础上过表达mreB后，部分细胞 形态变得不规则，都比野生形的体积大。
[0008] W上原理同样适用于其他细胞分裂基因、骨架合成基因W及障碍细胞体积增大的 细胞壁合成相关基因的操作引起的微生物细胞体积增大，比如ftsZ系列基因、mreB、mreC、 mreD、ftsi、rodZ、mrdA、mr地、mbl等删除、过表达和各种结合，都能增大细胞体积。
[0009] 又如，sulA和minCDE是细胞分裂环形成的抑制基因，诱导表达sulA或/和 minCDE，使细胞只分裂不分离，细胞体积进一步增大，可W观察到菌体生长从颗粒状变成的 纤维状，胞内空间增大不仅提高了内含物的积累量，而且纤维状细胞有利于下游分离细胞 和提取内含物。
[0010] 细胞体积的变大是否能够导致细胞内部可W容纳更多的内含物，成为目前研究的 热点。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的是提供一种提高微生物胞内内含物积累量的方法。
[0012] 本发明提供的方法，为通过改造影响微生物体积大小的基因增大微生物体积，实 现提高所述微生物胞内内含物积累量。
[0013] 上述方法中，所述通过改造影响微生物体积大小的基因增大微生物体积为如下 1)-3)中至少一种：
[0014] 1)改变细胞分裂的基因，所述改变细胞分裂的基因的方式包括分别或结合删除和 过表达细胞分裂基因、细胞骨架合成基因W及障碍细胞体积增大的细胞壁合成相关基因；
[0015] 2)改变细胞形状和体积的基因，所述改变细胞形状和体积的基因包括支撑细胞的 骨架基因皿eB、mreC、mreD、ftsi、rodZ、mrdA、mr地或mbl;
[0016] 3)改变细胞形状和体积的基因，所述细胞形状和体积的基因包括细胞分裂环形 成的抑制基因sulA、FtsZ蛋白抑制因子Min家族蛋白minCDE、细胞分裂环起始形成基因 ftsZ、细胞壁合成相关基因dd化、皿cA、皿cB、pbpC、dacB、dacA、dacC、pbpG、dacD、ampC或 ampHo
[0017] 上述提高微生物胞内内含物积累量的方法可W为敲除出发菌基因组中的mreB基 因，且向所述出发菌中共同导入mreB基因和sulA基因，且向所述出发菌中导入含有P皿合 成基因的质粒，得到的重组菌为Escherichia coliJM109SGA皿eB(ptk01，pBHR68);其出 发菌可W为Escherichia coliJM109SG;
[0018] 所述含有P皿合成基因的质粒具体为地HR68。
[0019] 上述方法中，所述敲除出发菌基因组中的mreB基因通过同源重组实现，mreB基因 的上游同源臂的核巧酸序列为序列表中序列1自5'末端第1-57位核巧酸;mreB基因的下 游同源臂的核巧酸序列为序列表中序列1自5'末端第1361-1417位核巧酸；
[0020] 上述方法中，所述向出发菌中共同导入皿eB基因和sulA基因为通过重组载体向 出发菌中共同导入mreB基因和sulA基因；所述重组载体包括驱动mreB基因表达的启动子 PmreB、mreB基因、ParaBAD、sulA基因、pSClOl复制子和卡郝抗性基因。所述重组载体具体 为ptKOl，其核巧酸序列为序列表中的序列2。
[002。 所述同源重组为将含有mreB上游同源臂、。1?1\1(111、。1?1\11^68下游同源臂的0臟片 段（序列1)导入出发菌中，实现敲除出发菌基因组中的mreB基因。
[0022] 上述提高微生物胞内内含物积累量的方法可W为向所述出发菌中导入mreB基 因，且导入含有P皿合成基因的质粒；其出发菌可W为Escherichia coli JM109SG;
[0023] 所述含有P皿合成基因的质粒具体为地HR68。
[0024] 上述方法中，向所述出发菌中导入mreB基因的方法为通过重组载体向所述出发 菌中导入；所述重组载体包括驱动皿eB基因表达的启动子PmreB、皿eB基因、复制子和氯霉 素抗性基因。所述重组载体具体为pxrOl，其核巧酸序列为序列表中的序列3。
[0025] 所述提高微生物胞内内含物积累量的方法可W为向所述出发菌中导入minCD基 因，且导入含有P皿合成基因的质粒；其出发菌可W为盐单胞菌TD08 ;
[0026] 所述含有P皿合成基因的质粒具体为地HR68。
[0027] 上述方法中，所述向所述出发菌中导入minCD基因的方法为通过重组载体向 所述出发菌中导入MinCD基因；所述重组载体为将含有Lacr-Ptrc启动子和minCD 基因的DM片段插入表达载体中，得到的载体，其中表达载体为PSEVA341，重组载体 P沈VA341-Lacr-Pt;rc-MinCD为将序列表中序列4所示的核巧酸Lacr-Ptrc-MinCD插入 PSEVA341载体的甜al和SacI酶切位点间得到的载体；
[002引所述含有Lacr-Ptrc启动子和minCD基因的DNA片段的核巧酸序列具体为序列 表中序列4。
[0029] 所述提高微生物胞内内含物积累量的方法可W为敲除出发菌基因组中的si曲、 17巧和lytD基因，且导入含有P皿合成基因的质粒；其出发菌可W为枯草芽抱杆菌168;
[0030] 所述含有P皿合成基因的质粒具体为地HR68。
[0031] 上述方法中，所述敲除通过同源重组实现；其中，用于敲除出发菌si曲基因的 上游同源臂为序列15自5'末端第20-613位核巧酸，下游同源臂为序列15自5'末端第 614-1201位核巧酸；
[0032] 用于敲除出发菌l^E基因的上游同源臂为序列16自5'末端第20-1025位核巧 酸，下游同源臂为序列16自5'末端第1851-2765位核巧酸；
[0033] 用于敲除出发菌lytD基因的上游同源臂为序列17自5'末端第20-1184位核巧 酸，下游同源臂为序列17自5'末端第2265-3436位核巧酸。
[0034] 所述同源重组具体为将含有Si曲上下游同源臂的DNA片段（序列15自5'末 端第20bp-12(nbp)通过重组载体pCU-Si曲（序列15)、含有l^E上游同源臂、抗性基因 Spe和下游同源臂的DNA片段（序列16自5'末端第20bp-276化P)通过重组载体 pCU-l^E-spe(序列16)和含有lytD上游同源臂、抗性基因血和lytD下游同源臂的DNA 片段（序列17自5'末端第20bp-343化P)通过重组载体pCU-l^D-Em(序列17)共同导入 168中，通过同源重组替换其基因组上的Si曲、l^E和lytD基因；
[0035] 所述提高微生物胞内内含物积累量的方法可W为敲除出发菌基因组中的dacA、 ddlB、ampC、ampH和mrcB基因，且导入含有P皿合成基因的质粒；其出发菌可W为 EscherichiacoliJM109SG。
[0036] 所述含有P皿合成基因的质粒具体为地HR68。
[0037] 上述方法中，所述敲除出发菌基因组中的dacA、ddlB、ampC、ampH和mrcB基因通 过同源重组实现，其中，
[0038] 用于敲除出发菌基因组中的dacA基因的上游同源臂核巧酸序列为序列5,下游同 源臂的核巧酸序列为序列6;
[0039] 用于敲除出发菌基因组中的ddlB基因的上游同源臂核巧酸序列为序列9,下游同 源臂的核巧酸序列为序列10;
[0040] 用于敲除出发菌基因组中的ampC基因的上游同源臂核巧酸序列为序列11，下游 同源臂的核巧酸序列为序列12;
[0041] 用于敲除出发菌基因组中的ampH基因的上游同源臂核巧酸序列为序列13,下游 同源臂的核巧酸序列为序列14 ;
[0042] 用于敲除出发菌基因组中的mrcB基因的上游同源臂核巧酸序列为序列7,下游同 源臂的核巧酸序列为序列8。
[004引上述同源重组为将含有dacA上游同源臂、。31\1(111^1?1\(1曰04下游同源臂的0臟片 段（序列见实施例3的一）、含有ddlB上游同源臂、FRT、Km、FRT、ddlB下游同源臂的DNA 片段（序列见实施例3的一）、含有ampC上游同源臂、。1?1\1(111^1?1\曰111口0下游同源臂的0臟 片段（序列见实施例3的一）、含有ampH上游同源臂、FRT、Km、FRT、ampH下游同源臂的DNA 片段（序列见实施例3的一）、含有皿cB上游同源臂、。1?1\1(111^1?1\皿08下游同源臂的0臟 片段（序列见实施例3的一）均导入EscherichiacoliJM109SG中，通过同源重组替换基 因组中的dacA、ddlB、ampC、ampH、皿cB基因。
[0044] 上述方法中，所述内含物为聚3居基了酸醋（P皿)、蛋白质、聚磯酸或碳小体。
[0045] 上述方法中，所述出发菌或微生物为细菌，所述细菌为大肠杆菌、嗜盐菌、假单胞 菌或芽抱杆菌。
[0046] 由上述的方法制备的重组菌也是本发明保护的范围。
[0047] 上的重组菌在提高微生物胞内内含物积累量中的应用也是本发明保护的范围。 [004引上述应用中，所述内含物为聚3居基了酸醋（P皿）、蛋白质、聚磯酸或碳小体。
[0049] 所述微生物为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，所述革兰氏阳性菌具体为芽抱杆 菌，所述革兰氏阴性菌具体为大肠杆菌、嗜盐菌或假单胞菌。
[0050] 本发明通过基因操作，增大了细菌体积，从而增加了微生物胞内内含物包括聚3 居基了酸醋（P皿）、蛋白质、聚磯酸或碳小体（Carboxysome)等的积累量。本发明所用的微 生物可W是革兰氏阴性和阳性菌、包括但不仅限于大肠杆菌、嗜盐菌、假单胞菌、芽抱杆菌 等。
[0051] 本发明提供的增大细菌体积的方法，主要是通过分别或结合删除和过表达细胞分 裂基因、细胞骨架合成基因W及障碍细胞体积增大的细胞壁合成相关基因来实现的。比如 从出发菌中通过同源重组法敲除细胞分裂基因和/或者障碍细胞体积增大的细胞壁合成 相关基因如皿eB、皿eC、皿eD、ftsi、rodz、皿dA、皿地、mbl,还可W在此基础上在质粒上补 偿表达敲除的基因和诱导表达分裂环形成的抑制基因，然后将质粒转化到敲除株，得到重 组菌A;另一方面，也可在出发菌中过表达细胞分裂基因W及障碍细胞体积增大的细胞壁 合成相关基因，比如皿eB、皿eC、皿eD、PBP2、PBP3、RodA、RodZ、皿dA、皿地、mbl,得到重组 菌B。由此产生的重组菌在大量积累内含物的情况下体积不断增大，或者从颗粒状细菌成为 纤维丝状细菌，两者都能使内含物产量增加。
[0052] 本发明中的微生物胞内内含物包括聚3居基了酸醋（P皿)、蛋白质、聚磯酸或碳小 体（Carboxysome)等，既可由野生微生物合成，也可由外源基因表达获得。
[0053] 本发明用微生物内含物包括聚3居基了酸醋聚3居基了酸醋（P皿)、蛋白质、聚磯 酸和碳小体等进行了实验，发现增大微生物细胞体积确实使聚3居基了酸醋聚3居基了酸 醋（P皿)、蛋白质、聚磯酸和碳小体等胞内内含物的产量得到提高。
[0054] 所述sulA基因诱导型启动子为阿拉伯糖启动子，序列如序列表中序列2自5'末 端第3785-5017位核巧酸，但不限于阿拉伯糖启动子。
[00巧]所述出发菌为大肠杆菌，具体为Escherichia coliJM109SG。但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)。
[0056] 所述化eB编码基因通过重组载体ptkOl导入所述基因组上皿eB敲除的中间菌。
[0057] 所述敲除方法中的同源重组片段氨基酸序列为序列表中序列1。
[0058] 所述重组载体ptkOl为通过Gibsonassembly方法得到的载体。
[0059] 所述重组载体ptkOl和pxrOl中mreB基因的启动子序