一种快速检测灰飞虱离子型γ-氨基丁酸受体基因突变的方法
【专利说明】-种快速检测灰飞動离子型γ-氨基Τ酸受体基因突变的 方法 -、技术领域
[0001] 本发明基于昆虫的离子型丫-氨基下酸受体是苯基化挫类杀虫剂（包括氣虫腊和 乙虫腊等）的作用祀标，设及一种快速准确鉴定灰飞風对此类型杀虫剂祀标突变的方法。 二、技术背景
[0002] 灰飞風Laodel地axstriatellus(Fall6n)是水稻的重要害虫之一，其不仅刺吸 取食水稻、小麦、玉米及高梁等多种作物，更重要的是传播水稻条纹叶枯病毒巧iceStripe Virus,RSV)、水稻黑条矮缩病毒巧iceBlackStreakedDwarfVirus,RBSDV)、小麦丛矮病 毒（WheatRosetteSl:untVi;rus，WRSV)及玉米粗缩病（MaizeRou曲DwarfVirus,Μ畑V) 等病害，并且传毒造成的危害远大于直接刺吸危害。由于至今没有理想的防治病毒病的药 剂，治虫防病成为挽回损失的主要手段（班兰风等，2015)。
[0003] 昆虫离子型丫 -氨基下酸受体（GABArec巧tor)主要介导神经和肌肉细胞中快速 的抑制性突触传递，研究表明其畑L亚基（resistancetodiel化in,抗狄氏剂）是环戊二 締类和苯基化挫类杀虫剂的分子祀标，但目前至少有19种昆虫已报道产生了抗性突变，其 中灰飞風的RDL亚基第283位氨基酸也产生了与氣虫腊抗性有关的A2'N突变，电生理试验 表明突变的受体会对降低对药剂的敏感性（化kaoetal.，2011)。目前关于灰飞風抗药性 的监测大都局限于室内药剂毒力生物测定，尚未见到相关快速检测的报道，然而生测结果 并不能对祀标抗性产生精准判断，并且存在实验周期长，虫量需求大等却缺点，因此在生产 实践中需要一种能够快速检测灰飞風抗性突变的方法。
[0004] 氣虫腊、乙虫腊和下締氣虫腊同属于苯基化挫类杀虫剂，对刺吸式和巧嚼式口器 害虫具有较高的杀虫活性。1994年，氣虫腊在我国获得首个登记并开始用于水稻、蔬菜害虫 的防治，但由于长期不合理使用，一些重要农业害虫（如小菜蛾、烟粉風、斜纹夜蛾W及二 化惧等）已报道对氣虫腊产生了抗药性，再加之氣虫腊会对农作物周围的蜜蜂、蝴蝶、蠕艇 等造成影响，因此氣虫腊于2009年在我国被限制使用，目前只允许作为卫生用药等部分旱 田作物种子包衣剂登记。然而乙虫腊和下締氣虫腊仍可用于水稻害虫能防治，并已有报道 证明了田间品系的灰飞風种群产生了对乙虫腊的A2'N的抗性突变巧Izakietal. ,2015)， 因此昆虫对于苯基化挫类杀虫剂还存在着一定抗性突变发生的风险。 阳0化]需要说明的是，虽然刘泽文等先前已申请公布了《褐飞風对苯基化挫类杀虫剂抗 药性分子检测方法》（专利号：201110003232. 9)的专利（刘泽文等，2013)，然而，褐飞風与 灰飞風虽为同科但归为不同属种，且两者突变位点和检测验证方法也有较大差异，鉴于灰 飞風传毒危害多种作物W及苯基化挫类杀虫剂的抗性发展现状等诸多因素，因此考虑申报 此项专利，W期为农业害虫综合防治提供方法参考。 Ξ、
【发明内容】
[0006] 发明目的为了克服目前室内毒力生物测定方法灵敏度低、周期长、材料要求高等 现状，本发明提供了一种快速、灵敏、准确的方法来检测灰飞風离子型GABA受体对苯基化 挫类杀虫剂产生的抗性突变。
[0007] 技术方案W在室内用氣虫腊多年连续筛选的对苯基化挫类杀虫剂具有高水平抗 性品系灰飞風为试验对象，经过基因克隆手段已验证了其中大部分个体的RDL亚基基因已 产生了与氣虫腊抗性有关的A2'N突变，因此根据灰飞風RDL亚基的基因序列，在突变位点 处设计特异性引物，通过琼脂糖凝胶电泳结果来判断灰飞風对苯基化挫类杀虫剂的抗性水 平。
[0008] 有益效果本发明提供的特异性引物组合物能够有效鉴定出灰飞風离子型丫-氨 基下酸受体是否发生了A2'N突变，从而判断灰飞風对苯基化挫类杀虫剂的抗性水平，具有 操作简单、灵敏度高、准确性好、周期短、需要材料少等优点，与褐飞風突变检测相比（刘泽 文等，2013)，本方法设计引物少，操作更加简便，且在PCR过程不易产生引物二聚体（影响 电泳观察），同时，通过对PCR产物进行测序来验证结果正确性的方式更加简便准确，因此 本专利对于监测灰飞風田间种群对苯基化挫类杀虫剂的抗药性发展动态、指导合理用药和 延缓抗性发展具有重要意义。
【附图说明】
[0009] 图1为W室内抗性筛选和敏感纯化的灰飞風个体为模板，分别采用敏感引物对或 抗性引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
[0010] 1~5泳道为敏感纯合子（试虫来自于敏感品系），6~10泳道为杂合子（试虫来 自于抗性品系），11~15泳道为抗性纯合子（试虫来自于抗性品系），DNAMarker所示条 带大小如图。
[0011] 图2为灰飞風基因组畑L亚基基因扩增产物测序的峰图。 阳01引敏感/抗性纯合子在突变位置GTC(GC/AA)C为单一峰图，而杂合子为双峰，运与AS-PCR检测结果一致。 阳〇1引技术方案
[0014] W下所述的试验操作便于更好的理解本发明，但不限定本发明。下述内容中所用 试验材料与方法，如无特殊说明，均为常规材料和方法。
[0015] 1.等位基因特异性引物的设计
[0016] 根据克隆得到的灰飞風RDL亚基的基因组序列，按照等位基因特异性聚合酶链式 反应（AlleleSpecificPolymeraseQiainReaction，AS-PCR)引物设计原理和优化原则， 将突变型基因的A2'N位点后的碱基位置作为反向引物的3'末端（也可作为正向引物的 末端，但因其GC%含量过高，故本试验选择修饰反向引物），通过调整引物的长度（20bp左 右），使其退火溫度在50~60°C之间；再利用PrimerPremier5. 0软件设计最佳的上游通 用引物。普通的AS-PCR引物仅是在引物3'末端的碱基有所差异，本试验为了提高AS-PCR 引物的特异性，在下游引物3'端的倒数第Ξ个碱基的位置又引入一个错配碱基，最终形成 AS-PCR的下游引物，组成敏感/抗性引物对，克隆片段长度为26化P(序列表的序列1)。 阳〇17] 敏感引物对：
[0018] ASPCR-rdl-F607(序列表的序列 2) CCGAATCCCGTTGGTGTGTC
[0019] ASPCR-Srdl-R866(序列表的序列 3) ACCGTGGTGACGCCGAGAGC
[0020] 抗性引物对：
[0021] ASPCR-rdl-F607(序列表的序列 2) CCGAATCCCGTTGGTGTGTC
[0022] ASPCR-化dl-R866(序列表的序列 4) ACGGTGGTGACGCCGAGATT
[0023] 2.单头灰飞風基因组DNA的提取
[0024] (1)配制提取液A: 1 % (g/mL)SDS，50mmol/LTris·肥1，25mmol/L化Cl，25mmol/ L邸ΤΑ;提取液B:3mol/LKAC，PH= 7. 2。上述两提取液的溶剂均为超纯水，室溫保存； 阳0巧](2)将单头灰飞風试虫置于无菌2.OmL的EP离屯、管中，放入灭菌后的钢珠，加入 200μL的提取液A，用球磨仪进行研磨；
[0026] 做将匀浆后的样品65°C水浴比，每隔15min震荡混匀，加速组织裂解；
[0027] (4)加入等体积（200μL)的提取液B，满旋震荡混匀，冰浴化； 阳02引 （5) 10, 000Xg离屯、15min，小屯、将上清液转移到另一个无菌1. 5血ΕΡ离屯、管中；
[0029] (6)加入3倍体积化00μL)预冷的无水乙醇，满旋震荡混匀，-20°C放置化；
[0030] (7) 10,OOOXg离屯、15min，弃尽上清液，用70% (mL/mL)乙醇（现配现用）清洗两 次；
[0031] (8)用ΙΟμΙ移液器吸尽管底70% (mL/mL)乙醇，空气干燥沉淀20min，加入30μΙ 灭菌水溶解，-20°C保存备用。 阳03引 3.等位基因特异性PCR扩增及电泳检测
[0033] 为了最大程度提高等位基因特异性引物的专一性，试验针对AS-PCR反应体系W 及PCR循环条件进行了一系列的优化，最终确定了AS-PCR的反应体系及PCR循环条件：
[0034] (1)在200μL灭菌PCR管中建立总体积为20μL的反应体系：
[0035]
[0036] 似按W下程序进行PCR扩增：94°C预变性3min后，30轮循环：94°C变性30s，62°C 退火30s，72°C延伸30s;最后72°C延伸5min。
[0037] (3)电泳检测：取10μΙ扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳缓冲液为 1ΧΤΑΕ，恒压（120mV)电泳30min，DNAMarker(2000bp)，用紫外凝胶成像系统进行观察并 拍照保存。
[003引 （4)等位基因特异性PCR扩增及电泳检测
[0039] 4.ii序验证结果准确性
[0040] 为了验证方法的准确性，本试验在灰飞風RDL亚基突变所处的外显子7 (序列表的 序列5)适当位置设计引物A2N-rdl-F693(序列表的序列6)和A2N-rcQ-R893(序列表的序 列7)，对已用电泳鉴定出纯杂性的单头飞風基因组进行PCR扩增，方法参照上述3(1)部分， 取3μL电泳后条带单一即可送测（测序引物为A2N-rdl-F693)，测序结果如附图2所示，敏 感/抗性纯合子在突变位置GTC(GC/AA)C为单一峰图，而杂合子为双峰，运与AS-PCR检测 结果一致。
【主权项】
1. 特异性引物组合由序列表的序列2、序列3和序列4所示的三个单链DNA分子组成。2. 权利要求1所述特征性引物组合主要用于鉴定灰飞虱离子型γ -氨基丁酸受体基 因与苯基吡唑类杀虫剂有关的Α2' Ν突变，其特征在于所述的Α2' Ν突变位于灰飞虱离子型 γ -氨基丁酸受体RDL亚基基因开放阅读框第283位氨基酸由Α突变为Ν。3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述苯基吡唑类杀虫剂为氟虫腈、乙虫腈和 丁烯氟虫腈。4. 如权利要求2,其特征在于主要以下操作来实现： (a) 提取单头灰飞虱成虫基因组DNA; (b) PCR反应体系(c) PCR反应程序 94°(：预变性3!1^11;30轮循环：94°(：变性3〇8,62°(：退火3〇8,72°(：延伸3〇8 ;72°(：延伸 5min〇 (d) PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测 电泳检测：取10 yL扩增产物用2. 0%琼脂糖凝胶在恒压（120mV)电泳30min，用紫外 凝胶成像系统进行观察并拍照，其中用敏感引物对扩增得到单一条带的样本个体为敏感纯 合子，用抗性引物对扩增得到的单一条带的样本个体为抗性纯合子，用敏感/抗性引物对 扩增得到的两个条带的样本个体为杂合子。
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测灰飞虱离子型γ-氨基丁酸受体基因突变的方法，主要通过如下步骤实现：提取单头灰飞虱成虫基因组DNA；设计特异性引物；采用优化后的PCR反应体系和程序进行扩增；PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测。该发明操作简便、灵敏度高、时间短，它属于害虫抗药性治理的范畴，对于监测田间种群对苯基吡唑类杀虫剂抗性基因频率、指导合理用药和延缓抗性发展具有重要意义。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105331612
【申请号】CN201510755372
【发明人】高聪芬, 魏琪, 吴顺凡, 王利祥, 慕希超
【申请人】南京农业大学
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年11月5日