一种人工合成的BT抗虫基因FLAc及其应用

文档序号:9575168阅读:905来源:国知局
一种人工合成的BT抗虫基因FLAc及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程和生物防治技术领域,具体设及一种人工合成的BT抗虫基 因FLAc及其应用。
【背景技术】
[0002] 苏云金芽胞杆菌度acillusthuringiensis,简称Bt)是一种分布非常广泛的革 兰氏阳性菌。早在1901年从染病的家蚕体液中分离出一种对部分鱗翅目(Lepidoptera) 昆虫具有毒杀作用的细菌,即化。研究发现化在芽抱形成过程中,菌体的一端或两端会形 成一个或多个具有生物活性的蛋白质伴胞晶体,能在一些昆虫体内活化成有毒性的蛋白, 并与昆虫中肠上皮细胞的特异性受体结合,使其产生穿孔,从而杀灭昆虫。
[0003] 化的杀虫活性与伴胞晶体(parasporalcrystal)有关,人们称运种蛋白质为 δ-内毒素(δ-endotoxins)或杀虫晶体蛋白(insecticidalciystalprotein,ICP),而 将编码运种蛋白的基因统称为化基因。目前已经从不同化的亚种中分离出400多种化 基因,它们编码的杀虫晶体蛋白对鱗翅目、双翅目、銷翅目、膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目 等多种昆虫,W及线虫、蛾类和原生动物具有特异性的杀虫活性。由于该蛋白还具有对人畜 无害,不污染环境等优点,化基因已成为目前世界上应用最为广泛的抗虫基因。
[0004] 将具有溶胞作用的杀虫晶体蛋白归到切t类,其余归为化y类,相应的基因记为 切t和化y。本专利中设及的FLAc基因编码的杀虫晶体蛋白为化y类。杀虫晶体蛋白是根 据氨基酸同源性进行分类的。同源性在45%W下,为第一等级,用阿拉伯数字表示;同源性 在45%~78%之间,为第二等级,用大写英文字母表示;同源性在78%~95%之间,为第 Ξ等级,用小写英文字母表示;同源性在95%W上,为第四等级,用阿拉伯数字表示。例如 CrylAt)2。 阳0化]对已经获得的化y蛋白家族X-ray结构研究结果表明,化y蛋白家族的Ξ维结 构典型特征是含有明显能区分出来的Ξ个Domain,即DomainI、DomainII、DomainIII。 DomainI由7个α螺旋组成,是杀虫蛋白发挥功能的主要区域,参与了杀虫蛋白低聚物形 成和插入细胞膜形成穿孔导致细胞死亡的过程,其中第1、3、4和5个α螺旋在发挥功能起 到最关键作用。已有的研究表明:第1个α螺旋是启动杀虫活性的部位,当第1个α螺旋 被切除后,杀虫蛋白低聚物开始形成,并插入细胞膜导致跨细胞膜穿孔。第3个α螺旋是不 同杀虫蛋白亚基相互结合形成低聚物的区域。第4和5个α螺旋形成发卡化ai巧in)结 构,是杀虫作用的具体执行区域,主要功能是杀虫蛋白形成低聚物的结合点也是插入细胞 膜形成跨膜穿孔的区域(化talie,etal., 2001)。DomainII由β折叠组成3个loop环, 主要参与杀虫蛋白与受体结合。DomainIII由β折叠组成轮状拓补结构,主要参与杀虫蛋 白与受体的识别,是不同化化y蛋白识别不同害虫的主要功能区域,DomainII和Domain III共同决定祀标害虫的类型度ravo,etal., 2007)。化y蛋白家族成员之间虽然氨基酸序 列不同,但是在Ξ维结构上相对保守,表明该家族所有成员具有相似的杀虫机制(Cohen,et al. , 2008)ο
[0006] 由于化杀虫蛋白对祀标害虫群体的生态选择压和化杀虫蛋白特异识别昆虫体内 的特定受体特性,为昆虫不断进化而产生抗性后代提供了极大的概率。1985年首次报道了 印度谷惧对稻谷化抱子杀虫剂产生了抗性,经过研究发现实验室条件下给印度谷惧连续 饲喂亚致死量抱子杀虫剂15代后就会出现抗性种群(McGau曲ey,1985)。1997年,在夏威 夷种植的豆瓣菜喷施化杀虫剂400倍W上时,出现了野生小菜蛾(Plutellaxylostella) 抗性群体化iu和化bashnA,1997)。在实验室条件下通过给昆虫饲喂化y杀虫蛋白已经人 工筛选出了多个抗性昆虫种群(自然条件下野生型没有产生抗性),进一步证明了长期大 量使用一种化y蛋白必定会导致抗性昆虫的产生灯油ashnA,et曰1.,2005)。目前为止, 自然条件下共发现了Ξ个鱗翅目害虫对Bt制剂产生了抗性:印度谷惧、小菜蛾和粉纹夜蛾 (McGau曲ey,1985 ;Τ油ashn;Lk,1994;Janmaat和Myers, 2003)。同时,还报道了四起昆虫 对化农作物产生抗性的事件:在美国棉铃虫对化ylAc的抗虫棉产生抗性灯油ashnA,et al.,2008);在波多黎各斜纹夜蛾对化ylF转基因玉米产生抗性(Storer,etal.,2010);在 南非玉米楷夜蛾对化ylAb玉米产生抗性(vanRensburg,2007);在印度棉红铃虫对化ylAc 转基因棉花产生抗性度agla,2010)。
[0007] 自然界中,由于在化菌对祀标昆虫具有特异的毒杀作用,导致祀标昆虫为了生存 而产生一些突变来抵抗化菌的毒杀,最终导致对化菌产生抗性。为了适应祀标昆虫的进 化,化菌体内杀虫蛋白尤其是化y蛋白家族也在不断发生突变,从而维持对祀标害虫的杀 虫活性。通过化y蛋白家族系统进化分析表明该家族成员的进化主要有两个途径:即Ξ 个结构域的独立突变和不同杀虫蛋白之间DomainIII的交换度ravo, 1997;deMaagd,et al.,2001)。Ξ个结构域的独立突变主要是不同的结构域内部发生氨基酸突变,不同结构域 之间的突变互不影响,该途径突变最终导致新杀虫蛋白不断的产生,是新杀虫蛋白不断的 产生地主要途径。DomainIII是化y蛋白与受体蛋白的识别区域,是决定祀标的主要功能区 域,不同杀虫谱化y蛋白之间通过交换DomainIII结构域可W增加杀虫蛋白的杀虫谱。天 然存在的不同杀虫蛋白之间DomainIII的交换,发生交换的杀虫蛋白DomainIII的氨基酸 序列具有高度的相似性。此外,据报道通过人工交换不同杀虫蛋白之间DomainIII构建的 融合化y蛋白可W提高杀虫蛋白的杀虫效率,例如通过交换化ylAb和化ylC的DomainIII 构建了一个新的化y蛋白(lAb-lAb-lC),该蛋白对甜菜夜蛾幼虫的杀虫活性比单纯化ylAb 和化ylC杀虫活性高出十倍W上(deMaagd,etal.,2000)。最新报道表明通过交换不同杀 虫蛋白之间的DomainIII可W扩大杀虫谱,将Cry3Aa的DomainI和II与CrylAb的Domain III融合获得的新蛋白能够对玉米根蛋叶甲产生毒杀作用,而化y3Aa和化ylAb对其没有活 性(Walters,etal. , 2010)。
[0008] 自从转化杀虫蛋白基因作物问世W来至上个世纪末,世界范围内相继有二十多 个国家和地区开始种植转化基因的农作物。而近10年来随着转化杀虫基因农作物的不 断推出和种植面积的持续上升,除欧洲之外,几乎全球所有的陆地都种植了转化杀虫基因 农作物。据统计2009年全球的转化杀虫基因农作物种植总面积超过了 5亿公顷,占全部 转基因农作物种植面积的36%。其中2. 17亿公顷种植了只含有化杀虫基因的转基因农 作物,2. 87亿公顷种植了转抗除草剂基因和化杀虫基因的农作物(James, 2010)。美国是 转化杀虫基因作物种植面积最大的国家,其次是印度、阿根廷、己西和中国。尽管转化化y 杀虫基因作物对环境的影响在政府和公众之间存在较大的争议,但是化杀虫基因农作物 产生的巨大生态效益却得到了广泛的认可。发展化农作物不仅可w减少农药使用量节约 喷施农业所用的石油燃料,也可W通过鼓励实施免耕法种植转基因作物来减少C〇2排放量 和保护±壤及水分流失。此外,大面积种植转化杀虫蛋白基因农作物,不仅减少了喷施农 药的次数(从每生长季16次降低至2-3次),而且减少了使用农药引起的中毒事件,结合 作物增产10%带来的经济效益使农民增收多达40%W上,取得了巨大的经济、社会、生态 效益(Subramanian和Qaim,2010)。通过监测农药环境影响指数(environmentalimpact quotient,El曲发现,1996-2008年种植转基因作物共减
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