一种使用甘草渣作为发酵原料制备丁二酸的方法
【技术领域】
[0001] 本专利设及一种使用甘草渣作为生物发酵的碳源制备下二酸的方法，属于生物工 程技术领域。
【背景技术】
[0002] 甘草又名蜜草，豆科植物，自古就有"灵草"，"国老"等美名。为多年生草本植物， 可入药。
[0003] 甘草渣是甘草中有用物质被提取后剩余的残渣，它含有丰富的纤维素、半纤维素、 多糖类物质。随着甘草的大面积开发，甘草渣也逐渐成为危害生态环境的又一物质。对甘 草渣的合理利用越来越引起人们的重视。
[0004] 甘草渣中含有丰富的纤维素、半纤维素，可W经过一定的处理，并使用纤维素酶水 解后可作为发酵原料，运样既可W解决废弃甘草渣对生态的破坏问题，同时又可W最大程 度提高甘草的利用价值。
[0005] 下二酸（succinicacid)又名班巧酸，广泛存在于生物体中，是一种重要的二元有 机簇酸，也是微生物Ξ簇酸循环糖酵解途径的重要代谢产物。下二酸在很多领域有着广泛 的应用，可用于合成可降解塑料，医药领域的镇定剂，食品工业的食品添加剂，表面活性剂 等。因此，下二酸的高效、低成本的生产方法也成为近年来研究的热点，其中采用生物发酵 的方法制备下二酸是重中之重。
[0006] 降低生物发酵法下二酸制备成本的一个主要方向是使用低廉的碳源，如何有效的 利用自然界的生物资源，既能满足人们正常的生活需求，又能降低对环境的污染是一个非 常有意义的课题。无疑，综合利用甘草渣将对企业和社会具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是为了克服W上不足，提供一种使用甘草渣作为发酵原料制备下二 酸的方法。
[0008] 本发明的目的运样实现： 一种使用甘草渣作为发酵原料制备下二酸的方法，其制备方法如下： (1)本发明甘草渣的预处理： ① 按1:10的质量比称取干燥的甘草渣和摩尔浓度为1~5%的稀硫酸水溶液； ② 将甘草渣在50~70°C的的稀硫酸水溶液中浸泡1-3小时； ③ 浸泡结束后，将固体滤出，使用摩尔浓度为Imol/L的氨氧化钢水溶液调整PH值为 4. 0-4. 5,溫度调整至38-40度。
[0009] ④加入纤维素酶进行水解，水解时间为24小时，得甘草渣水解液，所述甘草渣水 解液固液比为3-5% ;将甘草渣水解液进行浓缩，浓缩至总糖含量达到350g/l，得甘草渣水 解糖液。
[0010] (2)配置发酵培养基 采用去离子水配制发酵培养基lOOmU发酵培养基的组成成分按质量浓度计为：蛋白 腺5g/l，玉米浆lOg/l，总还原糖含量lOOg/l，憐酸二氨钟2. 5g/l，憐酸氨二钢2. 5g/l，酵 母膏5g/l，乙酸钢1邑/1，用去离子水配制，其中总还原糖取自甘草渣水解糖液。
[0011] (3)一级培养 将菌种放入种子培养液中进行培养，培养时间为14h; (4)二级培养 一级培养后接种子培养基，接种量为4%，培养时间达到化后得培养液。
[001引 （5)S级培养 将培养液接入发酵培养基，在发酵罐中二氧化碳的通入量为0. 5~化/min,发酵过程中 流加摩尔浓度为Imol/L的氨氧化钢溶液维持发酵系统的抑值在5. 5~6. 5之间，溫度为 37~39°C，发酵时间为4她，发酵结束时钢离子浓度达到1. 5%，发酵结束后得下二酸。
[0013] 上述一种使用甘草渣作为发酵原料制备下二酸的方法，其中，优选地，所述发酵过 程中流加摩尔浓度为Imol/L的氨氧化钢溶液维持发酵系统的抑值为6.0~6.2。
[0014] 上述一种使用甘草渣作为发酵原料制备下二酸的方法，其中，所述使用的纤维素 酶为诺维信纤维素酶Carezyme?4500L。
[0015] 上述一种使用甘草渣作为发酵原料制备下二酸的方法，其中，所述使用的菌株为 班巧酸放线杆菌（Actinobacillussuccinogenes)CGMCC1593。
[0016] 上述一种使用甘草渣作为发酵原料制备下二酸的方法，其中，发酵使用的碳源为 甘草废渣经过处理得到的纤维素、半纤维素水解后的产物。
[0017] 本发明的有益效果为： 通过对甘草渣的预处理，将甘草渣内的木质素去除，采用酸解和酶解将半纤维素和纤 维素转化为发酵下二酸所需的糖源，运对于降低生物法制备下二酸的原料成本和降低甘草 废渣对于环境的污染有极大的作用。
【具体实施方式】
[0018] 实施例中所用到的甘草渣购自于甘肃宁县恒瑞康药业有限责任公司。对甘草渣进 行检测，其检测主要项目包括纤维(包括半纤维素）含量，蛋白含量，灰分含量，水含量。
[0019] 蛋白含量的测定，采用微量凯氏定氮法，参考GB/T5009. 5-1985。
[0020] 纤维的测定，是通过将干燥后的定量的甘草渣在浓硫酸和重铭酸钟的混合液中进 行氧化分解，并使用硫代硫酸钢反滴过量的高儘酸钟的方法。
[0021] 水分的测定，采用直接干燥法，参考GB/T-14769-93。
[0022] 灰分的测定，参考GB5009. 4-85 根据W上方法的检测，甘草渣（干）含有纤维及半纤维素23.6%，蛋白含量为7.5%，灰 分24. 2%，其他含量(包括木质素）为44. 7%。
[0023] 实验中发现，甘草渣纤维素与木质素结构较为致密，预处理使用19?^5%稀硫酸比 较适合。
[0024] 本发明实施例中所使用的TSB培养液为膜蛋白腺大豆肉汤。
[00巧]本发明所用菌株班巧酸放线杆菌（Actinobacillussuccinogenes)CGMCC1593， 已在中国专利化200610038113. 6中公开，公开号CN1814747A，公开日2006年8月9日。
[0026] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0027] 实施例1 (1)本发明甘草渣的预处理： ① 按称取1.2kg干燥无水的甘草渣和12kg摩尔浓度为5%的稀硫酸水溶液； ② 将甘草渣在70°C的的稀硫酸水溶液中浸泡2小时； ③ 浸泡结束后，将固体滤出，使用摩尔浓度为Imol/L的氨氧化钢水溶液调整PH值为 4.0,溫度调整至40度。
[0028] ④加入纤维素酶进行水解，水解时间为24小时，得甘草渣水解液，所述甘草渣水 解液固液比为5%;使用液相色谱检测纤维素酶水解液中葡萄糖含量为1. 9%，木糖含量约 为0. 2%，纤维素糖化率达到了 50%W上；将甘草渣水解液进行浓缩，浓缩至总糖含量达到 350g/L〇
[0029] (2)配置种子培养基 采用去离子水配制种子培养基lOmU种子培养基的组成成分按质量浓度计为：蛋白腺 5邑/1，玉米浆20g/l，葡萄糖20g/l，憐酸二氨钟1. 5g/l，憐酸氨二钢1. 5g/l，酵母膏5g/L。
[0030] (3)配置发酵培养基 采用去离子水配制发酵培养基lOOmU发酵培养基的组成成分按质量浓度计为：蛋白 腺5g/l，玉米浆lOg/l，总还原糖含量lOOg/l，憐酸二氨钟2. 5g/l，憐酸氨二钢2. 5g/l，酵 母膏5g/l，乙酸钢1邑/1，用去离子水配制，其中总还原糖取自甘草渣水解糖液。
[0031] (4)将种子培养基与发酵培养基分别放入灭菌锅中，在12rC的条件下灭菌 20min，将菌种放入TSB培养液中进行培养，接种子培养基，接种量为4%，培养时间达到化后 得培养液。
[0032] (5 )将培养液接入发酵培养基，在发酵罐中二氧化碳的通入量为化/min，发酵过程 中流加摩尔浓度为Imol/L的氨氧化钢溶液维持发酵系统的抑值在6. 0~6. 1之间，溫度为 37~39°C，发酵时间为4她，发酵结束时钢离子浓度达到1. 5%，发酵结束后得下二酸。
[003引实施例2 (1)本发明甘草渣的预处理： ① 按称取1kg干燥无水的甘草渣和10kg摩尔浓度为2%的稀硫酸水溶液； ② 将甘