检测人tert基因启动子突变的探针法及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种检测基因突变的方法及其试剂盒，特别设及一种检测人TERT基 因启动子突变的实时巧光定量PCR化qman探针法及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 端粒酶（telomerase)是一种由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白复合体，属于反转 录酶，与端粒的调控机理密切相关，起着维持细胞永生化和致癌的关键作用。端粒酶逆转录 酶（telomerasereversetranscriptase,TERT)是端粒酶的重要催化部分，TERT基因位于 人类第5号染色体，其中该基因的两个启动子突变位点，1，295, 2280T和1，295, 250OT(分 别称为C228T和C250T)尤为常见，运两种突变已被证实能够增强TERT启动子转录活性。 TERT启动子区突变不存在于正常的人类受试者及公共基因数据库，而表现为恶性肿瘤特异 性体细胞的遗传改变，因此对于运两种突变的检测在监测人类肿瘤发生的过程中发挥重要 作用。
[0003] TERT突变是原发性胶质母细胞瘤中出现频率较高（约为74. 2% )的基因突变之 一，在黑色素瘤、脂肪瘤、肝细胞癌、神经胶质瘤、膀脫癌等恶性肿瘤中都存在较高程度的 TERT启动子突变，最新研究显示：只携带TERT突变的III-IV级胶质瘤患者，其病理诊断结 果多为原发性胶母细胞瘤，且预后不良。因此，TERT突变为上述恶性肿瘤的发生和诊断提 供了一个生物标记，能帮助肿瘤早期诊断、分子病理分型和预后判断。目前，尚无对于TERT 基因特定点突变的检测方法。现有TERT基因的检测仅有通过原位杂交技术对TERT基因的 表达进行分析的，该方法必须基于细胞形态学，且不包含对TERT基因特定区域的扩增，因 此只有当TERT基因总表达量显著升高或降低时，才能用肉眼的方式观测到。而本发明采用 的巧光定量PCR方法是分子诊断领域应用的一种技术，该方法灵敏度高、可实时定量，是适 合临床大规模使用的方法。
[0004] 本发明还结合了扩增阻碍突变系统（amplificationrefractoiymutation system,ARM巧，ARMS于1989年建立，用于对已知突变基因进行检测。由于PCR过程中引物 延伸是3'端开始的，所W3'末端的碱基对引物的延伸来说非常重要。根据运个原理，将突 变与正常等位基因所不同的那个碱基安排在引物3'最末端，当反应进行时，如果引物3'末 端碱基与模板DNA序列匹配则可W扩增，如果不匹配，则链延伸反应就会因3'，5'-憐酸二 醋键形成障碍而受阻，从而达到区分检测等位基因的目的。
【发明内容】
阳〇化]为了实现对人TERT基因启动子突变的检测，从而为肿瘤病理分型、预后判断提供 参考，本发明提供了一种检测人TERT基因启动子突变的实时巧光定量PCR化qman探针法 及其试剂盒，该探针法和试剂盒为临床上提供了一种速度快、灵敏度高、特异性强的TERT 基因启动子突变检测体系。
[0006] 一种检测人TERT基因启动子突变的实时巧光定量PCR化qman探针法，包括W下 步骤： 阳007] (1)在TERTC228TPCR反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因 组DNA，形成C228T反应体系并进行巧光定量PCR扩增，和/或在TERTC250TPCR反应混合 液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成C250T反应体系并进行巧光定 量PCR扩增，其中：
[0008] 所述TERTC228TPCR反应混合液中包括溶解在PCR预混液中的W下组分：具有如 序列表中SEQIDNo. 1所示序列的TERTC228T上游特异性引物、具有如序列表中SEQID No. 2所示序列的TERT通用引物、具有如序列表中SEQIDNo. 3所示序列的TERT通用探针、 具有如序列表中SEQIDNo. 4所示序列的内参上游引物、具有如序列表中SEQIDNo. 5所 示序列的内参下游引物和具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的内参探针；
[0009] 所述TERTC250TPCR反应混合液包括溶解在PCR预混液中的W下组分：具有如 序列表中SEQIDNo. 7所示序列的TERTC250T上游特异性引物、具有如序列表中SEQID No. 2所示序列的TERT通用引物、具有如序列表中SEQIDNo. 3所示序列的TERT通用探针、 具有如序列表中SEQIDNo. 4所示序列的内参上游引物、具有如序列表中SEQIDNo. 5所 示序列的内参下游引物和具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的内参探针；
[0010] (2)结果判断：根据人类基因组DNA在C228T反应体系和/或C250T反应体系进 行巧光定量PCR扩增时的突变Ct值进行分析。 1] -种检测人TERT基因启动子突变的实时巧光定量PCR化qman探针法，所述样品 可W是利用脑胶质瘤样本术后冰冻组织或者石蜡组织或者活检穿刺组织作为检测标本，包 括：间变性少突胶质瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、少突细胞瘤、部分脑胶质瘤前体组织和 少量正常脑组织、垂体瘤组织样本。
[0012] 一种检测人TERT基因启动子突变的实时巧光定量PCR化qman探针法，其中： 阳01引 C228T反应体系为：在16-20μ1TERTC228TPCR反应混合液中加入1-4μ1、浓度 为2-lOng/μ1的人类基因组DNA，优选在18μ1TERTC228TPCR反应混合液中加入2μ1、浓度为long/μ1的人类基因组DM;所述TERTC228TPCR反应混合液中各组分在PCR预混 液中的浓度为：所述TERTC228T上游特异性引物的浓度为2-4μM，优选3μΜ;所述TERT通 用引物的浓度为2-4μM，优选3μΜ;所述TERT通用探针的浓度为2-4μM，优选3μΜ;所述 内参上游引物的浓度为1-3μΜ，优选2μΜ;所述内参下游引物的浓度为1-3μΜ，优选2μΜ; 所述内参探针的浓度为1-3μΜ，优选2μΜ;
[0014] C250T反应体系为：在16-20μ1TERTC250TPCR反应混合液中加入1-4μ1、浓度 为2-lOng/μ1的人类基因组DNA，优选在18μ1TERTC250TPCR反应混合液中加入2μ1、 浓度为lOng/μ1的人类基因组DM;所述TERTC250TPCR反应混合液中各组分在PCR预混 液中的浓度为：所述TERTC250T上游特异性引物的浓度为2-4μM，优选3μΜ;所述TERT通 用引物的浓度为2-4μM，优选3μΜ;所述TERT通用探针的浓度为2-4μM，优选3μΜ;所述 内参上游引物的浓度为1-3μΜ，优选2μΜ;所述内参下游引物的浓度为1-3μΜ，优选2μΜ; 所述内参探针的浓度为1-3μΜ，优选2μΜ。
[0015] 一种检测人TERT基因启动子突变的实时巧光定量PCR化qman探针法，其中PCR 的扩增过程为：37°C3min;95°C3min;95°C15s，65°C45s，15 个循环；95°C15s，60°C45s，25 个循环，在60°C45s阶段收集巧光。
[0016] 一种检测人TERT基因启动子突变的实时巧光定量PCR化qman探针法，其中所述 TERTC228TPCR反应混合液和/或TERTC250TPCR反应混合液中，PCR预混液中还溶解 有加TP和尿喀晚DNA糖基化酶；所述加TP在PCR预混液中的浓度为0. 05-0.8μM，优选 0. 2μΜ，所述尿喀晚DNA糖基化酶在PCR预混液中的浓度为0. 005-0. 02U/μ1，优选0. 01U/ μ1。 阳017] -种检测人TERT基因启动子突变的实时巧光定量PCR化qman探针法，其中：所述 结果判断步骤中Ct值进行分析为： 阳0化]当TERTC228TPCR反应体系中的内参信号呈现"S"曲线、内参扩增曲线 9《Ct《14时，可W判断待测样本C250T突变的阴性和阳性：当C228T反应体系中的 ΔCt《9时为C228T突变阳性；当C228T反应体系中ΔCt〉9时为C228T突变阴性，其中 ΔCt=样品扩增曲线的Ct值-内参扩增曲线的Ct值；
[0019] 当TERTC250TPCR反应体系中的内参信号呈现"S"曲线、内参扩增曲线 9《Ct《14时，可W判断待测样本C250T突变的阴性和阳性：当C250T反应体系中的 ΔCt《9时为C250T突变阳性；当C250T反应体系中ΔCt〉9时为C250T突变阴性。
[0020] 一种检测人TERT基因启动子突变的实时巧光定量PCR化qman探针法，还使用了 弱阳性对照液和/或空白对照液，所述弱阳性对照液为TERTC228T突变率和TERTC250T 突变率均为10%的人类基因组DM,或者是按照如下方法制备的弱阳性对照液：含有C228T 和C250T双突变的阳性质粒溶解在没有C228T或C250T突变的人类基因组DNA水溶液中， 使得阳性质粒与没有C228T或C250T突变的人类基因组DNA的拷贝数为1:9,所述阳性质粒 与没有C228T或C250T突变的人类基因组DNA在弱阳性对照液中的核酸总浓度为2-lOng/ μ1，优选为long/μ1 ;所得水溶液与TERTC228T突变率和TERTC250T突变率均为10 %的 人类基因组DNA按照本发明中的实时巧光定量PCR化qman探针法、在相同的反应体系和扩 增条件下进行PCR扩增，扩增曲线吻合。所述空白对照液是TE缓冲液。 W21] -种检测人TERT基因启动子突变的实时巧光定量PCR化qman探针法，在 16-20μ1，优选18μ1的TERTC228TPCR反应混合液中加入1-4μ1，优选2μ1的弱阳性 对照液，形成C228T反应体系的阳性质控反应体系，并进行巧光定量PCR扩增，和/或在 16-20μ1，优选18μ1的TERTC250TPCR反应混合液中加入1-4μ1，优选2μ1的弱阳性对 照液，形成C250T反应体系的阳性质控反应体系，并进行巧光定量PCR扩增。 W22] -种检测人TERT基因启动子突变的实时巧光定量PCR化q