快速定量测定白酒发酵过程微生物群落组成的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域中的微生物群落操作方法，是基于口特异性引物 (地ylum-specificprimer,PSP)，测定白酒发酵过程中微生物群落组成结构的快速 PSP-qPCR定量方法。
【背景技术】
[0002] 天然复杂微生物群落一般由几十、几百甚至更多不同种微生物组成，而且该组成 在不同的环境条件下会发生动态变化。几乎所有的天然微生物群落所包括的菌种的大部分 人类都了解甚少，所W对白酒发酵过程中天然微生物群落进行现场快速的结构组成定量还 非常困难。目前常见的技术包括：
[0003] -是传统培养方法；比如鲁泥中大部分微生物属于未培养菌，使用传统培养基培 养鲁泥微生物速度慢，鉴定工作量很大；
[0004] 二是焦憐酸高通量测序方法；运是目前国内外流行的一种群落结构定量测定方 法，一般通过生物技术公司委托服务来完成，价格昂贵，可W返回的测序个数高达几十万 条，一般可W定性定量到属；
[0005] S是FI甜技术；FI甜即fluorescenceinsi1:uhybridization技术是基于碱基 互补的原则，将一小段（通常15-30个碱基，比如16SrRNA片段）巧光标记的核酸序列作 为探针，与载玻片上的目标样本杂交，与祀序列专一结合，通过检测杂交位点巧光来显示特 定核巧酸序列的存在与数量；
[0006] 四是DGGE/TGGE技术；DGGE即dena1:uredgradientgelelectro地oresis技术 是由Fischer和Lerman1979年最先提出用于检测DM突变。Myers等1985年在DGGE中 使用"GC夹板"和异源双链技术。Muzyer等1993年证实运种技术在研究微生物群落遗传 多样性和种群差异方面非常有效。后来代替化学变性剂的溫度梯度凝胶电泳（temperature gradientgelelectro地oresis,TGGE)是衍生技术。DGGE/TGGE是依据双链DNA片断烙解 行为的不同，分离PCR产物中长度相近但序列不同的DNA标记片断（rRNA或rDNA)。DGGE/ TGGE图上的一个条带可代表一个微生物类群，分类水平可达种，可方便判断出优势菌或功 能菌；
[0007] 五是T-RFL技术；T-RFLP即Terminal-Restriction打agmentlength poly-mo巧hism技术，是由RFLP发展而来。T-RFLP技术原理是将PCR-条引物标记巧光， 将PCR扩增产物用限制性内切酶消化，产生不同长度的限制性片段，其中一部分含有巧光， 形成T-RFLP图谱，掲示样品中微生物的种类、数量等信息；
[0008] 六是RAPD技术；RAPD是一种DNA多态监测技术，通过PCR扩增，扩增产物经琼脂 糖凝胶电泳分离、漠化乙锭染色后，来检测DNA片段多态性。是一种对整个未知序列的基因 组进行多态性分析的分子技术。RATO技术独特之处在于：1)模扳DNA的需量少，纯度要求 低，采用随机引物；2)操作简便快速，不需分子杂交等步骤，直接进行DNA多态性分析；3) 所需引物短，在整个基因组内的结合位点多，覆盖率大，引物可混用，可运用多种引物对基 因组进行大面积的多态分析；4)检出率高。但RATO结果重现性差；
[0009] 屯是SSCP技术；1989年，日本科学家化ita利用DNA单链构象具有多态性， 在非变性聚丙締酷胺凝胶电泳时迁移率的不同来分析DNA单链中的基因突变并提出了 SSCP(Single-StrandConformationPolymo巧hism)的概念。Lee等将SSCP技术应用于 微生物群落的组成分析。化ita等用敏感的银染法直接对电泳后的凝胶进行染色，建立了 PCR-SSCP分析法，提高了检测突变方法的简便性和灵敏性。PCR-SSCP法优点：1)可用非同 位素方法检测，PCR产物变性后可直接电泳；2)实验对DNA原始材料纯度要求不高，需量少、 成本较低；3)适于大样本筛查，无需事先知道DNA序列；4)可检测任何DNA位点上的多态性 和突变，灵敏性高。但该技术也有许多不足，比如分析结果受多种因素的影响，不同的实验 条件可能导致完全不同的结果；
[0010]八是AFLP技术；AFLP(AmplifiedRragmentLengthPolymo巧hism)技术 1993 年 由荷兰Zabeau和Vos创建，结合了RFLP和RAPD技术特点，克服了RFLP技术复杂、有放射 性危害和RAPD技术稳定性差、标记呈现隐性遗传的缺点，同时兼有RAPD的高效性和RFLP 的可重复性特点。该技术被认为是目前DNA指纹图谱技术中多态性最为丰富的一项技术， 其主要优点：所需DNA量少、重复性好、多态性强、分辨率高、不需要杂交等。但费用昂贵、对 DNA的纯度和内切酶的质量要求较高等。
[0011] 但是，上述所有技术都无法做到现场两小时左右的快速测定白酒发酵过程中微生 物群落的组成结构。
【发明内容】
[0012] 本发明是为避免上述现有技术所存在的不足，提供一种定量识别效果显著、制备 简便、成本低廉的快速定量测定白酒发酵过程微生物群落组成的方法。
[0013] 本发明为解决技术问题采用如下技术方案：
[0014] 本发明快速测定白酒发酵过程中微生物群落组成的方法的特点是：通过在PCR反 应体系中使用口特异性引物达到白酒发酵过程中对具体某个口的微生物菌群进行特异性 扩增，并使用qPCR体系进行定量扩增，获得定量识别。
[0015] 本发明快速测定白酒发酵过程中微生物群落组成的方法的特点也在于：按如下步 骤制备口特异性引物：
[0016] 步骤a、提取酿酒微生物群落样本的宏基因组作为聚合酶链式反应扩增模板；
[0017] 步骤b、扩增所述扩增模板中的核糖体DNA接近全长16srDNA序列，扩增引物为 27F(5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，）和 1492R(5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，）， 获得扩增产物；
[0018] 步骤C、对于所述扩增产物经过纯化后依次进行TA克隆、蓝白斑筛选及白斑菌落 双向测序，获得不少于200个的有效克隆，所述有效克隆是指最后的双向测序序列经过序 列比对确实属于16srDNA序列；
[0019] 步骤t对于所述有效克隆双向测序序列通过进化树分析，完成引物设计。
[0020] 本发明快速测定白酒发酵过程中微生物群落组成的方法的特点也在于：
[002。 对所述qPCR体系的配置：是使用qPCR试剂盒及qPCR仪器，并要求qPCR仪器可W检测对应试剂盒包含的巧光物质，所述巧光物质包括EvaGreen和SYBRgreen;
[0022] 对于所述qPCR体系的条件的设定与运行；依据不同微生物群落和不同的口进行 扩增条件的调整优化，定量识别同一个群落的不同的口时设计的引物尽量具备相近的Tm 值，W便在相同的扩增条件进行测试和应用；
[0023] 对于所述qPCR体系的产物的检测：在方法建立过程中，通过琼脂糖凝胶电泳检测 扩增产物的纯度和质量；在扩增产物达到单一主带且Tm值分析具备单一产物峰时，不再 需要跑胶检测产物，使用时qPCR只需要通过Tm值分析判断即可，利用qPCR仪器同时导出 qPCR扩增曲线、定量结果及Tm值分析结果。
[0024] 本发明快速测定白酒发酵过程中微生物群落组成的方法的特点也在于：
[0025] 所述口特异性引物为拟杆菌口特异性引物，其引物对核巧酸序列为：
[0026] 320巧'-CGC ACG GGT GAG TAA CAC GTAT-3'），321(5'-GGG GAT AM TCC TCT CAG TTC CCCT-3')；
[0027] 所述口特异性引物或为变形菌口的特异性引物，其引物对核巧酸序列为：
[0028] 317(5'-CCG TAG CTG GTC TGA GAG GAT GAT AA-3'），319巧'-CAC GCT TTA CGC CCA GTA ATT CCYA-3'）；
[0029] 所述口特异性引物或为厚壁菌口的特异性引物，其引物对核巧酸序列为：
[0030]JU5' -CAG CAG TGG GGA ATC TTCC-3'），J2巧' -TAG CCG GGG CTT CCT CCT-3'）；
[0031] 所述口特异性引物或为互养菌口特异性引物，其引物对核巧酸序列为：
[0032] J7 (5, -AAA CCG CTT TCA GCA GGG AC-3,），J8 (5, -TAA CTC CCG ACC AAA CAA GC-3'）。
[0033] 所述口特异性引物或为放线菌口特异性引物，其引物对核巧酸序列如下所示：
[0034] J9(5'-AGC GAA CGG GAT TAG ΑΤΑ CCC C-3'），J10(5'-AGG TAA GGT TCT