微滴数字PCR（ddPCR）检测土壤中TCK冬孢子的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及微滴数字PCR(ddPCR)检测±壤中TCK冬抱子的方法，属于小麦矮腥黑 粉菌防治领域。
【背景技术】
[0002] 小麦矮腥黑穗病是由小麦矮腥黑粉菌（Tilletiacontroversa肺hn，TCK)引起的 重要国际检疫性病害，也是我国对外检疫的一类危险性植物病害。该病害危害大、防治难， 一旦传入会给小麦生产带来毁灭性危害，通常发病率约等于小麦产量损失率。据化ffmann 报告，在流行年份，因TCK引起的损失率一般为20%~50%，最高可达75%~90%。除了 产量损失外，被侵染的小麦出粉率也会随着感染严重程度而降低，并且因含有TCK冬抱子 而极大地影响品质。TCK的寄主范围很广，危害小麦、大麦、黑麦等禾本科18个属的70多种 植物，其中，对小麦危害最严重。小麦矮腥黑粉菌对我国的小麦生产存在潜在危机，该病在 栽培条件下的主要寄主为冬小麦，我国常年小麦种植面积约2300万hm2,其中冬小麦占绝 大部分，西北、黄淮海等广大冬麦区均适合小麦矮腥黑粉菌的定殖和发生危害，随着我国加 入WT0及与TCK疫区国家-美国小麦贸易的增加，TCK传入我国的可能性日益增大，因此， 必须加强小麦矮腥黑穗病的早期预警及检疫检测，为病害防治提供技术储备。冬季小麦矮 腥黑粉菌冬抱子潜藏在±壤中，定性定量检测±壤中小麦矮腥黑粉菌冬抱子的含量，对于 早期预警和预防病害，具有重要的意义。
[0003] 聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR)是分析检测样品中核酸分子 最常用的方法。目前，应用最多、灵敏度最高的核酸定量技术是实时巧光定量聚合酶链式 反应，其准确度可达95%，检测时将未知的目标核酸分子和已知标准样品同时进行扩增，根 据加入的巧光分子探针信号实时观察模板的扩增情况，检测结果W线性的扩增信号形式输 出，根据已知标准样品的扩增曲线来推算未知样品的起始模板拷贝量。因此，巧光定量PCR 技术是一种相对的核酸定量方法，其灵敏度和准确度均受到限制。qRT-PCR在分析外源基 因拷贝数时必须依赖于标准曲线和已知拷贝数的基因，只是一种相对定量方法，且标准曲 线的质量易受到DNA纯度、引物和探针的浓度、反应抑制因子等诸多因素影响（Cankaret al.，2006);另外，标准曲线必须基于标准物质建立，而标准物质的种类有限和昂贵价格不 能适用于所有的研究。并且，小麦矮腥黑粉菌抱子体积质量都非常小，而±壤中微生物种类 多，TCK的DNA在±壤样品总DNA中的比例极低，有必要采用灵敏度更高的方法进行定量分 析。
[0004]数字PCR(化opletdigitalPCR，ddPCR)是近10年兴起的第Ξ代PCR技术。通 过极度稀释实现理论上的单分子扩增，然后用终点法PCR和泊松分布计算出样品的原始浓 度。斯洛文尼亚科研人员利用微滴ddPCR(化opletdigitalPCR，ddPCR)检测转基因玉米 M0N810的外源基因含量，从而开启了新一代PCR技术检测转基因食品的先河。ddPCR将预 混合的PCR反应体系随机分散到数千万个微滴中形成油包水的结构，保证每个微滴中仅含 有一个或不含有模板分子。每个微滴在各自的反应体系中进行PCR扩增，扩增的产物通过 之前添加的探针发出巧光信号从而实现定量目的。由于微滴中模板的存在情况满足泊松分 布，根据发出巧光信号的数目代入泊松分布公式计算即可得出样品的定量结果。而且，该方 法无需依赖外部核酸标准，因此可实现对核酸分子的绝对定量分析；其定性和定量检测限 比传统定量PCR低，能分别达到5个和6个拷贝数，比定量PCR灵敏度高1000-10000,其他 方面如特异性和重复性较之于传统定量PCR也存在极大的优势。鉴于运种微滴反应能极大 程度分散反应体系，它可W有效消除抑制因子的作用，保证检测过程中的扩增效率，对检测 低含量目标核酸分子的样品有良好的效果。
【发明内容】
[0005] 根据上述领域存在的不足和需求，本发明提供一种微滴数字PCR检测±壤中TCK 冬抱子的方法，能够对±壤中的小麦矮腥黑粉菌进行绝对定量，有利于及时采取防治措施， 防止小麦矮腥黑穗病的发生。
[0006] 本发明要求保护的技术方案如下：
[0007] 微滴数字PCR检测±壤中小麦矮腥黑粉菌的方法，其特征在于，包含如下步骤：
[000引 （1)提取待测上壤样品的总DNA;
[0009] (2)W待测±壤样品的总DNA为模板进行微滴数字PCR反应，得到PCR产物；
[0010] (3)将PCR产物放入微滴读取仪中读取信号，分析实验数据，获得±壤样品中小麦 矮腥黑粉菌的绝对含量，
[0011] 其特征在于，±壤中小麦矮腥黑粉菌的总DNA提取方法如下：
[0012] 将取回的±壤样品过网筛除去杂质；然后冷冻；
[001引采用FastDNA?SPINKitforSoil试剂盒提取±壤样品的总DNA，步骤如下：
[0014] (1)称取500mg±壤加到Lysing MatrixETube中；
[0015] (2)力日 978ulsodiumPhosphateBuffer到管中；
[001引 做加12化1MTBuffer;采用细胞震荡破碎仪w6. 5M/S震荡2分钟对±壤样品 进行处理；
[0017] (4) 14000r/min离屯、10 分钟；
[0018] (5)将上清液转移到一个2ml管，加入250ulPPS，混合均匀；
[0019] (6) 1400化/min离屯、5分钟，将上清液转移到一个新的2ml管；
[0020] (7)加入 1ml充分混匀的Binding Matrix ;
[0021] 做满旋2分钟，让DM充分结合基质，满旋后将管放到管架上静置3分钟；
[00过 （9)去除500ul上清液，避免碰到沉淀；
[0023] (10)重悬试管让BindingMatrix重新混匀，取约600ul的混合液转移到Spin Filter中，14000r/min离屯、1分钟，倒空流出液，再把剩下的上清液加入SpinFilter中， 140(K)r/min离屯、1分钟，倒出流出液；
[0024] (11)加500ul的已加入无水乙醇的沈WS-M到SpinFilter中，利用水流重悬里面 的固体；
[002引 （12) 14000r/min离屯、1分钟，倒出流出液；
[0026] (13) 14000r/min空离2分钟，W清空SpinFilter中剩余的沈WS-M液体；
[0027] (14)移动SpinFilter到新的化1:油Tube中，放置于室溫下风干5分钟；
[002引 （15)加入50ul的DES，用枪头轻轻揽动滤膜，将样品放到55度水浴锅中加热5分 钟；
[0029] (16)取出样品后，14000r/min离屯、1 分钟，弃掉SpinFilter,将CatchTube中的 DM放置于4度冰箱备用。
[0030]所述微滴数字PCR反应的体系为：10μL ddPCR Supermix for Probes,10μL/mol 正向引物和反向引物各1.8化，探针0.6化，DM模板2.0化，(1地2〇 3.8化。
[0031] 所述正、反向引物及探针引物的核巧酸序列为：
[0032]正向引物：5 ' -ACGACCGACTTTCCGAGAGC-3，，
[0033]反向引物：5，-GTGTGGGACGAAGGCATCAA-3，，
[0034]探针引物：FAM5, -ACGACTTGCGGTCCCTCCACA-3,TAMAR。
[0035] 所述微滴数字PCR反应的程序为：95°C预变性10分钟，1个循环；94°C变性15秒， 58°C退火30秒，72°C延伸30秒，10个循环；94°C变性15秒，60°C退火30秒，72°C延伸30 秒，30个循环。
[0036] 小麦矮腥黑粉菌抱子体积质量都非常小，而±壤中微生物种类多，TCK的DNA在± 壤样品总DNA中的比例极低，使用常规PCR检测不到小麦矮腥黑穗病菌，容易产生假阴性结 果。本发明提供的检测方法，通过冷冻处理待测±壤样品，改良DNA提取方法，从±壤中有 效提取出质量较好的DNA，再利用微滴数字PCR进行检测，实现了±壤中小麦矮腥黑粉菌的 绝对定量，有利于小麦矮腥黑穗病的早期预警，及时采取防治措施，减少经济损失。
[0037] 本发明提供的DNA提取方法能够有效地提取出±壤样品的总DNA，并且DNA的质量 较好，其0D260nm/0D280皿的比值均在1.8至1. 9左右，浓度均在200~30化g/μL，提高了 后续检测结果的可信度，避免因DM质量不好造成假阴性结果。
[0038] 本发明提供的方法利用灵敏度和准确度更高的微滴数字PCR