用于检测樱桃ssr标记的引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学DNA标记技术与应用领域，特别设及用于检测樓桃SSR标 记的引物。
【背景技术】
[0002] 简单重复序列（SimpleSequenceR巧eat,SSR)，也称为串联重复序列或微卫星标 记，是一种共显性标记，具有多态性高，重复性好，易于检测的优点，被广泛应用于种质资源 亲缘关系鉴定、遗传图谱构建、功能基因的筛选和分子标记辅助育种等工作中。SSR标记的 获取通常有3种途径，分别是：利用已公布的表达序列标签、利用已完成测序的基因组序列 和利用转录组序列。
[0003] 中国樓桃（Primuspseudocerasus)的近缘物种有桃（P.persica)、杏 (P.armeniaca)、李（P.salicina)和欧洲甜樓桃（P.avium)等，其中桃的基因组已经完成测 序。尽管用于桃遗传图谱构建、功能基因的筛选和分子标记辅助育种的SSR标记比较丰富， 而且同科或同属植物SSR标记有一定程度的转移性，但是多数情况下，侧翼序列突变导致 SSR标记向近缘物种转移的成功概率很低。截至2015年11月20日，GenBank公布的欧洲 甜樓桃表达序列标签巧ST)有6496条，中国樓桃仅有185条，但利用EST序列开发中国樓 桃SSR标记的研究尚未见报道。显然，由于GenBank登录的欧洲甜樓桃和中国樓桃的表达 序列标签数量非常有限，所能开发的SSR标记的数量也是有限的。应用新一代高通量测序 平台IlluminaHiseqTM2000能够W较低的价格、较快的速度获得较多的转录组信息，是大 量开发中国樓桃SSR标记的有效方法。因此，如能利用EST序列开发中国樓桃SSR标记，增 加樓桃属分子标记的数量，势必会对今后的樓桃育种工作带来极大的便利。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中樓桃分子标记数量不足的缺点，提 供一组用于检测樓桃属植物SSR标记的引物，增加樓桃属分子标记的数量W应用于今后的 育种工作中。
[0005] 为了解决技术问题，本发明提出了用于检测樓桃SSR标记的引物，该检测引物共 有9个引物对，其核巧酸序列如下：
[0006] 化2632-F和化2632-R的核巧酸序列分别如沈QIDNO: 1、2所示；
[0007] 化3793-F和化3793-R的核巧酸序列分别如沈QIDN0:3、4所示；
[0008] 化4400-F和化4400-R的核巧酸序列分别如沈QIDN0:5、6所示；
[0009] Unigenel3394-F和Unigenel3394-R的核巧酸序列分别如沈QIDN0:7、8 所示；
[0010] Unigenel3887-F和Unigenel3887-R的核巧酸序列分别如沈QIDN0:9、10 所示；
[0011] 化1旨611616590斗和化1旨611616590-1?的核巧酸序列分别如沈9 10側：11、12所示；
[0012] 化1旨611619771斗和化1旨611619771-1?的核巧酸序列分别如沈9 10側：13、14所示；
[0013] Unigene8656-F和Unigene8656-R的核巧酸序列分别如沈QIDNO: 15、16 所示；
[0014] 化4698-F和化4698-R的核巧酸序列分别如沈QIDNO: 17、18所示。
[0015] 本发明还提出上述用于检测樓桃SSR标记的引物在樓桃遗传多样性分析中的应 用。
[0016] 此外，本发明还提出利用上述用于检测樓桃SSR标记的引物进行樓桃遗传多样性 分析的方法，所述方法包括如下步骤：
[0017] 步骤I，各樓桃材料的DNA提取； 阳01引步骤II，微卫星分析：
[0019] (1)、PCR扩增：W步骤I提取的DNA为模板进行PCR扩增；
[0020] A:20μL反应体系包含：TaKaRaPremixTaq? 10化、正向引物0. 1化，反向引物 0. 5μL巧光修饰的M13引物0. 4μLlOngDNA模板和双蒸水； 阳02UB:反应程序：94°C预变性4min;94°C变性40s，54°C退火40s，72°C延伸40s，30个 循环后，改变循环条件为94°C变性40s，53°C退火40s，72°C延伸40s，进行8个循环，最后 72°C延伸6min; 阳02引 似、电泳检测：
[0023] 取上述扩增产物5μL加入1μL6XLoadingbuffer;在含有0. 5μg/μL邸的 1. 5%的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下拍照记录结果；
[0024] (3)、SSR基因分型和GeneMapper软件统计：
[00巧]选取上述在不同樓桃材料中电泳条带粗细、明暗、片段长度变化不一的标记1μL约lOOng的PCR产物与12μL变性剂和0. 25μL内参混匀，使用lippendorfMasteixycler PCR仪在95°C下变性5min，取出立即放置冰上5min，然后使用ABI3130遗传分析仪进行分 析，同时使用GeneMa卵er软件读取片段长度；
[0026] 步骤III，遗传多样性分析
[0027] 将GeneMa卵er统计得到的标记长度数据按照标准格式输入GenA化X6. 501，计 算樓桃材料的遗传多样性参数，绘制聚类图。 阳02引优选的，在上述正向引物的5'端统一加18bp的M13序列： 5' -TGTAAAACGACGGCCAGT-3'。
[0029] 优选的，所述巧光标识引物为5'端分别使用Fam和Hex两种巧光基团修饰的Ml3 引物，其中M13引物的序列为5' -TGTAAAACGACGGCCAGT-3'。
[0030] 优选的，所述樓桃材料为中国樓桃材料，来自如下：朱红1、临海地方品种1、朱砂 红、山樓1、朱红2、朱红3、山樓2、早红宝石1、朱红4、浙闽樓、早红宝石2、临海地方品种2、 诸暨地方品种、朱红5、仙居地方品种、中国樓桃1、中国樓桃2、中国樓桃3、中国樓桃4、大鹰 嘴、中国樓桃5、高盆樓桃。 阳〇3U 优选的，所述步骤I的DM提取步骤为：（1)配制DM提取液：2 %CTAB，0. 1M Tris，20mM邸TA，1. 4M化Cl，p册.0;DNA溶解缓冲液：10mMTris;lmM邸ΤΑ;PH=8. 0 ;似 对中国樓桃材料进行如下处理： 阳03引①在10血离屯、管中加入4血的DNA提取液和80μLβ-琉基乙醇，放置在65°C水 浴中预热lOmin;
[0033] ②取Ig中国樓桃材料的新鲜叶片，在研鉢放入少许PVP，加入液氮充分研磨；将研 磨好的叶片转移至含DNA提取液的离屯、管中，混匀后放入65°C水浴锅中水浴30min，每隔 lOmin摇匀一次，使叶片细胞充分裂解；
[0034] ③水浴结束后，取出离屯、管冷却至室溫；加入4血的预冷V:V= 24:1的氯仿/异 戊醇混合溶液，充分混匀后使用离屯、机在10 00化pm下离屯、15min;
[0035] ④用移液器小屯、吸取上清液，转移至新的10血离屯、管中，加入4血的异丙醇和 400化的3M的醋酸钢溶液，轻轻颠倒混匀，静置10-15min至产生絮状沉淀，然后使用离屯、 机在10 000巧m下离屯、lOmin;
[0036] ⑥离屯、后弃上清液，将底部白色沉淀即：DNA小屯、取出，转入1. 5血离屯、管中，加入 700μL70 %的乙醇洗涂两次；
[0037] ⑧离屯、后弃上清液，用移液器吸干剩余酒精，将白色沉淀物收集在侧管壁上，尽可 能铺平打薄，放入37Γ保溫箱中烘干；
[0038] ⑦加入500μLDNA溶解缓冲液将烘干后的DNA重新溶解，完全溶解后加入1μL RNase，用移液器轻轻吸打DM溶液，混匀后将离屯、管放入37°C保溫箱中保溫比；
[0039] ⑨取4μΙDNA在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测其完整性。 W40] ⑨吸取一部分DNA稀释至10-3化g·μL/用于后续的PCR反应，剩余部分置 于-20°C保存。
[0041] 相对于现有技术，本发明的有益效果是：
[0042] (1)本发明利用本课题组前期开发的中国樓桃"短柄"品种休眠花芽组织的转录组 信息寻找SSR位点，经13种中国樓桃品种或地方品种及7个野生中国樓桃共22个不同樓 桃基因型筛选，得到9个具有多态性的通用型标记。
[0043] 本发明筛选出9个SSR标记在22个中国樓桃种或品种中有多态性，在22个中国樓 桃种或品种