检测pd致病基因突变的方法,及其引物、试剂盒的制作方法

文档序号:9575268阅读:584来源:国知局
检测pd致病基因突变的方法,及其引物、试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属分子生物学技术领域,设及检测PD致病基因突变的方法,及其引物、试 剂盒。
【背景技术】
[0002] PD(Parkinson'sdisease)基因,大量研究证明GBA和LRRK2基因突变可能增加患 帕金森病的危险性,且在人群中的分布具有明显的种族差异性。GBA基因突变对PD发病潜 在影响的研究已成为目前PD研究的热点。中国人群中最常见的GBA基因突变则是L444P, 约占36%。LRRK2(富含亮氨酸重复序列激酶2)基因变异不仅能够导致晚发性家族型帕 金森病的发生,而且与散发型帕金森病也存在显著相关,为常染色体显性遗传性PD致病基 因。其变异具有种族的特异性,在LRRK2基因多态性中,G2385R和R1628P是二个东亚人群 的特异性位点,未出现于其他种族。
[0003] 现有的检测技术主要是基于单个突变位点的PCR和测序方法及单基因忍片方法, 缺点主要在于仅仅能检测单个突变位点,不能对多个突变位点进行同时检测,也不能对分 布于多个外显子的位点进行同时检测。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的在于克服上述不足,提供一种检测PD致病基因突变的方法,其解决 了现有技术中进行PD致病基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费时、易污染和灵敏度低等 问题。
[0005] 为了实现上述目的,本发明采用的技术方案为:一种检测PD致病基因突变的方 法,不用于疾病的诊断和治疗,其特征在于,其包括如下实现步骤:
[0006] 样本处理:取外周血2ml于邸TA抗凝管中,轻柔地颠倒混匀,4°C保存;
[0007]DNA提取,取200μL抗凝血用试剂盒提取DNA,包括:
[000引 1)加 200μ1BufferBL,震荡混合,于70°C解育10分钟;
[0009] 2)加200μ1无水乙醇震荡混合约20秒;
[0010] 3) 12000巧m离屯、1 分钟;
[0011] 4)取上清转入收集柱中,1200化pm离屯、2分钟;
[0012] 5)将收集柱置一个新的收集管上,加入500μ1皿solution,室溫放置5分钟; [001引 6) 12000巧m离屯、2分钟;
[0014] 7)加入 700μIwashBuffer, 12000巧m离屯、2 分钟;
[0015] 8)将收集柱置一个新的收集管上,加入700μ1washBuffer, 12000巧m离屯、2分 钟;
[0016] 9)弃收集管内液体,12000;rpm离屯、2min;
[0017] 10)将收集柱放入一个新的1. 5ml离屯、管内,加入50μ1 70°C预热的洗脱液,室 溫放置l-2min,12000巧m离屯、2分钟,滤液即为模板DNA;
[001引PCR扩增
[001引 PCR反应体系:
[0020] 10XPCRBuffer2. 5μ1 ;
[0021] HotStarTaqDMPolymerase按kit标准调整;
[0022] dNTPmix2μ1 ;
[002引上游引物PrimerU1μ1;
[0024]下游引物PrimerL1μ1 ;
[00巧]DM模板Xμ1 ;
[0026] 灭菌蒸馈水25μ1 ---上述总体积;
[0027] PCR产物电泳:1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果;
[0028] PCR产物纯化
[0029] 每管内加入100μ1PCR-A液,混匀,转入纯化柱内,12000巧m离屯、2min;
[0030]弃收集管内液体,加入 700μ1washingbuffer, 12000巧m离屯、2min;
[0031]弃收集管内液体,加入 400μ1washingbuffer, 12000巧m离屯、2min;
[003引弃收集管内液体,12000巧m离屯、2min;
[003引柱内加入30μ1 70 °C预热洗脱液,12000巧m离屯、3min;
[0034] 测序反应
[0035]反应体系:0. 8μ1Bi曲ye+1. 5μ1Bi曲yeSeqBuffer+3μ1引物+1μ1PCR纯 化产物+3. 5μ1dd&0;
[0036] 测序PCR热循环条件:
[0037] 1)变性的条件,96°ClOsec;
[0038] 5)退火的条件,(首先96°ClOsec,其次50°C5sec,然后60°C4min)X25个循环;
[0039] 6)延伸的条件,60°C4min;
[0040] 7)4°C保溫;
[0041] 每一步的时间应从反应混合液达到所要求的溫度后开始计算;
[0042] 测序产物纯化
[0043]lOul反应体系,96孔板,酒精/EDTA/NaAc法;
[0044]1)每管加入100μ1 100%酒精,或每管加入1μ1 125mM邸TA到管底,或每管加 入1μ1 3MNaAc到管底,然后震荡混匀,室溫放置15min;
[0045]2) 10°C,4000巧m离屯、30min,马上倒置,1200巧m离屯、Imin;
[004引 3)每管加入100μΙ70%酒精,离屯、15min;5°C,3600巧m离屯、30min,马上倒置, 1200巧m离屯、Imin;
[0047] 4)室溫挥发净酒精,加入10μ1Hi-Di化rmamide溶解DM;
[004引 W95°C变性5min,4°C保溫4min,加样上机;
[0049] 6)测序纯化:ABIBigdyeXTerminatorpurificationkit;
[0050]PCR检测,包括:
[0051] 1)对照孔的设立和检测重复孔:样本检测同时设有对照实验,包括阴性对照;对 照和样本均采用复孔;
[0052] 在PD基因突变位点两端设计Ξ对特异性引物;
[0053] 所述引物GBA-F的核巧酸序列为:
[0054] 5' -AATTGGGTGCGTAACTTTGTC-3',
[005引所述引物GBA-R的核巧酸序列为:
[0056] 5' -ACTTCCCAGACCTCACCATTG-3',
[0057] 所述LR服2-F1引物的核巧酸序列为:
[0058] 5' -TTGCTAAGCAAAATAGCCCTG-3',
[0059] 所述LR服2-R1引物的核巧酸序列:
[0060] 5' -AAGATGGTGCTGAGAAGCATTAC-3';
[0061] 所述LR服2-F2引物的核巧酸序列为:
[0062] 5' -AGATTTTGACAGTGAAAGTGGAAG-3',
[0063] 所述LR服2-R2引物的核巧酸序列:
[0064]日'-TAAGGTTTTCTTTACCTGCTTGG-3';
[0065] 所述引物PCR扩增出目的片段模板;
[006引所述目的片段的获取包括:W上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条 带单一的目的基因片段;将目的片段稀释至1万-10万倍,终浓度为10-2化g/μL作为检 测阴性对照用;
[0067] 。25 μ L反应体系检测:
[0068] 2XPowerTaqPC艮Mastei'MixterMIXl;erM悦 终浓度!χ DNA模板 l-lOng/μΙ Phmei.U 终浓度为400ηΜ PrimerL 终浓度为400nM 灭茵蒸傭水 υρ?ο25μ1
[0069] 混合均匀;所有样本混合完后,将ΑΒΙ Veriti Dx PCR系统仪器中进行程序性检 测;
[0070] 结果分析及判定:对PCR产物进行测序分析。
[0071] 本发明的另一目的在于提供一种检测PD致病基因突变的引物,其特征在于,所述 引物序列包括:
[0072]沈Q ID N0:15'-AATTGGGTGCGTAACTTTGTC-3'
[0073]沈Q ID N0:25'-ACTTCCCAGACCTCACCATTG-3'
[0074]沈Q ID N0:35'-TTGCTAAGCAAAATAGCCCTG-3'
[00巧]沈Q ID N0:45,-AAGATGGTGCTGAGAAGCATTAC-3,
[0076] SEQ ID N0:55'-AGATTTTGACAGTGAAAGTGGAAG-3'
[0077]沈Q ID N0:65'-TAAGGTTTTCTTTACCTGCTTGG-3'。
[0078] 本发明的还一目的在于提供一种包括所述引物的检测PD致病基因突变的试剂 盒。
[0079] 本发明的有益效果为:
[0080] 能对多个突变位点进行同时检测,也能对分布于多个外显子的位点进行同时检 ,简单、快速、准确、有效的对强直性肌营养不良两种突变类型进行检测和临床诊断,利用 多种特异性引物同时对患者可能存在的多个突变位点进行检测,使用该方法能保证95%W 上的疾病检出率。其解决了现有技术中进行PD致病基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费 时、易污染和灵敏度低等问题,尤其是提供了病理组织之外的非创伤性如血清或血浆等检 测。
【附图说明】
[0081] 此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解,构成本申请的一部分,本申 请的示意性实施例及其说明用于解释本申请,并不构成对本申请的不当限定。在附图中:
[0082] 图1是本发明PD致病基因检测分析结果示意图。
【具体实施方式】
[0083]W下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解,运些实施例是用于说明 本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可W根据具体厂家的条件做 进一步调整,未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
[0084] 实施例1
[0085] 样本处理:取外周血2ml于邸TA抗凝管中,轻柔地颠倒混匀,4°C保存;
[0086]DNA提取,取200μ1抗凝血用试剂盒提取DNA,包括:
[0087] 1)加200μ1BufferBL,震荡混合,于70°C解育10分钟;
[008引。加 200μ1无水乙醇震荡混合约20秒;
[0089] 3) 12000巧m离屯、1 分钟;
[0090] 4)取上清转入收集柱中,12000巧m离屯、2分钟;
[0091] 5)将收集柱置一个新的收集管上,加入500 μ 1皿solution,室溫放置5分钟;
[0092] 6) 12000巧m离屯、2 分钟;
[0093] 7)加入 700μ1wash Buffer,12000巧m离屯、2 分钟;
[0094]8)将收集柱置一个新的收集管上,加入700μ1wash Buffer,12000巧m离屯、2分 钟;
[009引9)弃收集管内液体,12000巧m离屯、2min;
[0096] 10)将收集柱放入一个新的1. 5ml离屯、管内,加入50μ1 70°C预热的洗脱液,室 溫放置l-2min,12000巧m离屯、2分钟,滤液即为模板DNA;
[0097]PCR扩增
[009引 PCR反应体系:
[0099]10XPCR Buffer2.5μ1;
[0100]HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整;
[0101]dNTP mix2μ1;
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