转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的侧翼序列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，设及一种用于转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的侧 翼序列及其应用。
【背景技术】
[0002] 玉米是全球种植范围最广、产量最大的谷类作物，居Ξ大粮食（玉米、小麦、水稻） 之首。我国是玉米生产和消费大国，播种面积、总产量、消费量仅次于美国，均居世界第二 位。近年来，虽然我国玉米发展势头良好，但仍需大量进口，且进口量逐年快速递增。随着 工业化、城镇化快速发展和人民生活水平不断提高，我国已进入玉米消费快速增长阶段。从 未来发展看，玉米将是我国需求增长最快、也将是增产潜力最大的粮食作物。抓好玉米生 产，就抓住了粮食持续稳定发展的关键。挖掘生产潜力、降低生产成本、保持玉米能够基本 自给，是确保国家粮食安全的关键。
[0003] 在我国玉米种植分布极为广泛，而杂草种类及危害也十分复杂，有调查表明：不 论是人工除草地块还是出苗前封闭除草地块，100%的田块都有杂草危害，危害严重的杂草 有禾本科、苹科、大戟科、寥科和鸭趾草科杂草。农田杂草给玉米生产带来极大的困扰及危 害。由于杂草比农作物具有更粗壮的根系；生长能力很强，繁殖快，密度大，数量多，与作物 争光、争肥、争水，因此，严重影响作物的产量和质量；许多杂草是农作物病虫害的中间寄 主，病菌，害虫因为杂草的存在而繁殖、传播。如碑草、狗尾草、芦韦是稻飞風、稻攝病、水稻 纹枯病的寄主。据保守估计，我国每年玉米草害面积达667万公顷，严重危害的占20%，每 年玉米因杂草危害而减产的损失率达10%W上。同时。杂草还带来了其它方面的危害，如 妨碍农事操作，影响人畜健康状况，造成灌概麻烦，增加生产费用和劳动力等。人工働草是 一种原始而有效的方法，但是效率低且辛苦繁重。在世界上许多地区，特别是发展中国家， 防治杂草是农业生产中用工量最多的工作。为了除草，要进行大量的耕、翻、祀、働、粉等作 业，结果加大±壤通透性，使腐殖质减少，并导致±壤冲刷与水±流失。转aroA、igrA、Ba;r、 Gat等抗除草剂基因玉米不但能有效的防治杂草，而且对环境、有益昆虫及人畜等均无不良 影响。
[0004] 近年来，生物技术的迅速发展大大地推动了植物育种研究手段的革新与研究水平 的不断提高，植物抗除草剂生物技术育种已开始进入实用化阶段。利用生物技术手段将外 源抗除草剂基因导入植物基因组内，打破了植物种属甚至物种之间难W杂交的天然屏障， 实现了抗除草剂基因的转移，从而使植物迅速地、定向地获得抗除草剂特性，同时又能保留 原有的良好农艺性状。由于草甘麟的广谱灭生性，因此使用草甘麟除草较人工除草防治效 果要好且稳定，还能够节省人力和物力，有效的节约社会资源。因此，培育和推广抗草甘麟 玉米品种在我国有着广阔的应用前景，将为玉米生产和农民增收提供保障。 阳0化]转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2是中国农业大学将CP4EPSPS基因按照玉米密 码子特征进行优化，获得了适合在玉米中高表达的EPSPS基因，优化的基因拥有自主知识 产权狂L201210406176.8)，同时克隆了高梁EPSPS基因的叶绿体信号肤（赵海铭等，《农业 生物技术学报》，2013, 21 (9) : 1009-1018)，将其与优化的EPSPS基因连接，命名为maroACC。 通过基因枪共转化的方法把maroACC基因转入到具有高转化效率的玉米自交系ΗΠΙΑ和 ΗΠΙΒ的杂交组合中，用草甘麟进行筛选，获得了 500余个maroACC蛋白阳性的转化体，通 过拷贝数检测及表达量筛选获得的一个优良转化体。在栽培地环境中，转基因玉米CC-2与 其对应的非转基因玉米在生育期、株高、产量等方面均一致，可正常生长；在荒地环境中，转 基因玉米CC-2及其对应的非转基因玉米与杂草相比不具竞争优势，无杂草化风险（宋新元 等.转基因抗除草剂玉米CC-2生存竞争能力研究.作物杂志，2014年06期）。
[0006] 如今转基因成分检测受到越来越广泛的关注，根据转基因插入片段的旁侧序列设 计转化体特异的检测引物是最为有效的检测方法。目前已经有部分专利和文献报道了转基 因植物外源插入载体旁侧序列，例如：彭于发等人于2007年利用基因步移和LD-PCR方法分 析了水稻品系科丰6号的外源插入片段的旁侧序列，建立了转基因水稻科丰6号的品系特 异性检测方法。然而，在对现有的专利和文献的分析中发现，还没有任何关于转maroACC基 因抗除草剂玉米CC-2的外源插入片段的旁侧序列的文章和专利报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的一个目的是提供一种用于检测或辅助检测待测玉米是否为转maroACC 基因抗除草剂玉米CC-2的引物对或引物对组。
[000引本发明所提供的引物对具体为引物对1或引物对2。
[0009] 本发明所提供引物对组具体由所述引物对1和所述引物对2组成。
[0010] 所述引物对1中的上游引物根据序列表中序列5的第1-500位设计获得，下游引 物根据序列表中序列5的第501-1000位设计获得，序列5中l-500bp为插入序列5'端侧 翼的玉米基因组序列，501-1000bp为插入序列的组成部分；所述引物对2中的上游引物根 据序列表中序列6的第1-500位设计获得，下游引物根据序列表中序列6的第501-1000位 设计获得，序列6中l-500bp为插入序列的组成部分，501-1000bp为插入序列3'端侧翼的 玉米基因组序列。 W11] 更加具体的，所述引物对1为如下（1)-做所示引物对中的任一种；所述引物对2 为如下（4)-(6)所示引物对中的任一种： 阳01引（1)由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对； 阳01引似由序列表中序列8和序列9所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
[0014] (3)由序列表中序列10和序列11所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
[0015] (4)由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
[0016] (5)由序列表中序列12和序列13所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
[0017] (6)由序列表中序列14和序列15所示的两条单链DNA分子组成的引物对。
[0018] 在本发明中，所述引物对中两个单链DNA分子既可W单独包装，也可W等摩尔混 合包装。所述引物对组中每个引物对的两个单链DNA分子既可W单独包装，也可W等摩尔 混合包装。
[0019] 所述引物对或所述引物对组在制备用于检测或辅助检测待测玉米是否为转 maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
[0020] 本发明的另一个目的是提供一种用于检测或辅助检测待测玉米是否为转maroACC 基因抗除草剂玉米CC-2的试剂盒。
[0021] 本发明所提供的试剂盒，具体包含有所述引物对或所述引物对组。
[0022] 所述试剂盒中还可含有PCR反应所需的常规试剂，如DNA聚合酶、dNTP等。
[0023] 所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。
[0024] 所述试剂盒的制备方法，可为如下（al)或（曰2):
[00巧](al)包括如下步骤：将所述引物对中的两条单链DNA分子分别单独包装；
[00%] (a2)包括如下步骤：将所述引物对组中每个引物对的两条单链DNA分子分别单独 包装。
[0027] 所述引物对或所述引物对组，或所述试剂盒，在检测或辅助检测待测玉米是否为 转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2中的应用也属于本发明的保护范围。
[002引本发明的再一个目的是提供一种检测或辅助检测待测玉米是否为转maroACC基 因抗除草剂玉米CC-2的方法。
[0029] 本发明所提供的检测或辅助检测待测玉米是否为转maroACC基因抗除草剂玉米 CC-2的方法，可为如下（A)或度）：
[0030] (A)包括如下步骤：
[00川 （al)W所述待测玉米的基因组DNA为模板，采用所述引物对1进行PCR扩增，获得 PCR产物；
[0032] (a2)根据所述PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测玉米是否为转 maroACC基因抗除草剂玉米CC-2 :若所述PCR产物中含有预期大小的DNA片段，则所述待测 玉米为或候选为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2 ;若所述PCR产物中不含有预期大小的 DNA片段，则所述待测玉米不为或候选不为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2 ;
[003引所述预期大小的DNA片段如下：若所述引物对1为由序列表中序列1和序列2所 示的两条单链DNA分子组成的引物对，则所述预期大小的DNA片段为292bp的DNA片段；若 所述引物对1为由序列表中序列8和序列9所示的两条单链DNA分子组成的引物对；则所 述预期大小的DNA片段为25化P的DNA片段；若所述引物对1为由序列表中序列10和序列 11所示的两条单链DNA分子组成的引物对，则所述预期大小的DNA片段为32化P的DNA片 段；
[0034] 度）包括如下步骤：
[0035] 化1)W所述待测玉米的基因组DNA为模板，采用所述引物对2进行PCR扩增，获得 PCR产物；
[0036] 化2)根