一种柯萨奇病毒ca10型荧光定量pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及核酸巧光PCR检测试剂盒，尤其设及萨奇病毒CA10型巧光定量PCR检 测试剂盒，属于手足口病的体外诊断领域。
【背景技术】
[0002] 手足口病化and.化ot-mouthdisease)是世界范围内流行的儿童常见病，主要发 生于3岁W下儿童，但偶有成人发病的报告，是由多种肠道病毒引起的，W发热和手、足、口 腔等部位出现瘤疹为主要特征的疾病，少数患病儿童可出现脑炎，急性弛缓性麻搏，屯、肌 炎，脑水肿等严重并发症，病情进展快，严重者可导致死亡。近些年来，手足口病在许多国 家，特别是亚太地区发生过多次的爆发或流行，越来越受到各国的关注。引起手足口病的病 原体多样，但都为单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科的肠道病毒。到目前为止，有文献 报道的20多个血清型可引起手足口病，主要有CA16、CA6、CA7、CA9、CA10、CB2、CB5、CB13、 ECH019W及EV71 型等。
[0003] 在日本和中国台湾，CA10与瘤疹性咽峡炎的爆发相关，部分感染CA10病人出现神 经系统症状，最近新加坡的报告指出，CA10和CA6在引起手足口病中的病原中与CA16和 EV71同等重要。2007-2008年，山东地区分离的330例HFM病毒株中有17例为CA10型。 2013年西安地区共报告手足口病临床诊断病例16964例中，柯萨奇病毒A6型（CA6)阳性 率为51. 12%，柯萨奇病毒A16型（CA16)阳性率为22. 1%，肠道病毒71型巧V71)阳性率 为11. 2%，柯萨奇病毒A10型（CA10)阳性率为4. 4%，其它肠道病毒阳性率为11.2%。在 2013年夏天，中国长春市爆发了手足口病，总共有1125例病人确诊为手足口病患者，大部 分均为5岁W下，总共220份手足口病样本被收集并进行检测，有101份化6. 9% )为CA6 感染，其他感染的肠道病毒包括CA2(1.3% )，CA10(1.9% )，CA14(0.6% )，CA16巧.9% )， CB4(1.3% )，EV71(19. 2% )和EC30(0.6% )。
[0004] 柯萨奇病毒CAIO型与其他柯萨奇病毒一样，属于小RNA病毒科，肠道病毒属 巧nterovirus)，致病谱广，是多种人类疾病的致病原。CA10病毒现在已经成为引起儿童 HFMD的主要病原之一。CA10病毒颗粒为二十面体对称球形，由核酸和蛋白质组成，无包膜 和突起。病毒颗粒核屯、含一开放阅读框架，编码的多聚蛋白经过自身蛋白酶水解，分为P1、 P2和Ρ3Ξ种前体蛋白。P1区前体蛋白又可编码病毒的结构蛋白P1~VP4,组成病毒衣壳。 目前常用的诊断方法为：病毒分离方法、血清学方法、PCR方法。 阳0化]其中，病毒分离方法利用组织培养、分离肠道病毒是目前诊断手足口病病原的金 标准，但是由于任何一种细胞都不可能对引起手足口病所有肠道病毒进行培养，所W，虽 然病毒培养技术是检测诊断肠道病毒的金标准，但此方法操作繁琐，分离率不高，在手 足口病的流行爆发期间，难W推广应用；血清学方法最常用的方法是酶联免疫吸附实验 巧LISA)，运种方法可W对单份血清或急性期和恢复期的双份血清进行检测，简单、快速，不 需要特别的仪器，非常适合基层医疗单位，但由于肠道病毒共同抗原表位的存在，所W均有 不同程度的交叉反应性；PCR(polymerasechain化ction，聚合酶链式反应），是一种分子 生物学技术，用于放大扩增特定的DM片段，可看作生物体外的特殊DM复制，即使采集的 标本中含有微量的病毒RNA或是失活病毒，也能经过PCR扩增后检测出来。与病毒分离W 及血清学检测相比，RT-PCR具有特异、简单、快速、敏感等优点，并且，扩增产物可W通过测 序之后用于分子流行病学分析。但是PCR也存在许多不足之处，PCR消耗试剂大、操作步骤 多、容易造成PCR污染，并且，PCR-次性检测的样本数有限，大规模检测时耗时耗力。
[0006] 结合国内情况，在临床HFM诊断中，实时巧光PCR技术凭借着快速、敏感、特异等 优点显示出了其临床诊断的优越性，目前只有极少量巧光PCR诊断试剂盒在CA6诊断中使 用，但是缺乏完善的质控体系，操作比较繁琐，灵敏度不高，还需要进一步完善和提高技术 水平，使此类产品更加满足临床准确快速诊断的需要。 阳007] 临床上检测CA10-RNA的方法目前主要是基于实时巧光定量PCR的技术及其改进， 实时巧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有巧光检测装 置的PCR扩增仪，巧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收 集检测巧光信号，通过检测巧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试 验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与巧光阔值线的交点（即Ct 值）W及扩增曲线的形状，可W判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考 品或标准品，则可W通过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值（即定 量检测）。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记巧光报告基团和 泽灭基团的探针。探针结构完整时，巧光报告基团发出的巧光能量被泽灭基团吸收，呈现泽 灭效应；如果扩增过程中有祀序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水 解切断，巧光报告基团与泽灭基团相互解离，阻断了二者间巧光能量转移效应，巧光报告基 团发出的巧光信号被巧光检测装置收集。随着扩增的进行，巧光信号随着目的片段的扩增 而呈现线性增强。试验结束后，可W通过巧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可W获得阴 阳性结果和样本浓度的定值结果，因此，该技术在祀多核巧酸样品的检测和定量分析中，已 逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。
[0008] 国内已有多种基于实时巧光定量PCR技术定量检测柯萨奇病毒CA10型的方法，运 些试剂盒所提供的CA10-RNA提取方法主要是Trizol法和柱提取法，但是，有W下不足之 处：（1)Trizol法虽然是最经典的RNA提取方法，但是操作繁琐，对于设备和人员操作要求 高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；柱提取方法虽然无需高速离 屯、，但是需频繁更换离屯、管，用时长，特异性较差；（2)无法有效去除样本中的PCR抑制物； (3)没有设置阳性内对照（即内标），无法监控假阴性；(4) 一般没有预防PCR产物污染的 措施；（5)现有方法检测灵敏度欠佳，可能出现漏检现象。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于解决现有柯萨奇病毒CA10型核酸巧光定量PCR检测试剂盒 的缺陷，提供一种具有操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽而准确柯萨奇病毒 CA10型核酸巧光定量PCR检测试剂盒，可W对人血清或咽拭子或瘤疹渗出液等标本中的柯 萨奇病毒CA10型进行定量分析，检测结果可用于柯萨奇病毒CA10型感染的辅助诊断和疾 病监控。
[0010] 本发明实施例中提供了一种柯萨奇病毒CA10型巧光定量PCR检测试剂盒，其包括 W下各组分：RNA提取溶液、RNA洗脱液、RT-PCR增强剂、内标、PCR反应液、CAIO阳性对照 品、CA10阴性对照品，其中，所述内标为插入PUC18T载体的一段长为128碱基对的人工合 成DNA序列的重组体，浓度为1. 00E+04copies/ml~5. 00E+04copies/ml;128碱基对的序 列如下所示：
[0011] 5'-GTCCAGTACTTTCAAAGCTCGATCCCGGTAACTACCAAATCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACCG ATCGCCTCTTCCCAACCTGTACGTACGTACGTACGTCCAAAAGTTTCCACGTACGATCGATC-3' 〇
[0012] 优选的，上述检测试剂盒，其中，所述RNA提取溶液包括如下组分： 阳01引 RNA提取溶液I:十二烷基硫酸钢，质量/体积0. 2 %~1. 0 %、曲拉通，体积/体积 1. 0%~4. 0%，异硫氯酸脈 0. 2mol/L~1.Omol/L、100μg/ml~400μg/ml的磁珠；
[0014] RNA提取溶液II:4-径乙基赃嗦乙横酸lOOmmol/L~300mmol/l、抑6. 5 + 0. 2,氯 化钢lOOmmol/L~300mmol/L；
[0015] RNA提取溶液III:曲拉通，体积/体积0. 1 %~1. 0 %、氯化钢lOOmmol/L~ 300mmol/L；
[0016] RNA提取溶液IV:矿物油。
[0017] 优选的，上述检测试剂盒，其中，所述RNA洗脱液为Tris-肥1 0.8