新的害虫防治方法

新的害虫防治方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明提供的技术设及通过将针对结构性銷蛋白（struc化ralsheath protein,SHP)的抑制剂渗入农业目标害虫体内的多种类害虫防治的方法，W及用于所述方 法的害虫防治试剂，W及转基因作物、溫室和观赏植物。
【背景技术】
[0002] 人类居住的环境被害虫侵扰所充斥。包括昆虫、蜘蛛、甲壳动物、真菌、细菌、病毒、 线虫、扁虫、咖虫、晓虫、钩虫、缘虫、锥虫、血吸虫、肤蛹、跳圣、婢、蛾W及風等的害虫遍布人 类环境。例如，包括晒虫的半翅目（order化miptera)昆虫是作物、园艺植物W及观赏植物 的主要害虫。
[0003] 在整个欧洲，仅由晒虫产生的直接损害造成平均每年700, 000吨小麦、850, 000吨 马铃馨和2,000,000吨甜菜的损失卿611111邑8口胖6*曰1.，1989)。在美国，因产量降低和农 药处理造成的小麦和大麦生产的年直接产量损失于1988年达到2. 74亿美元的峰值，1993 年回落到低于1千万美元（De化yverC-Aet曰1.,2010)。在英国，因晒虫造成8-16%的魏 豆、10-13%的小麦和5%的马铃馨的直接产量损失灯atchellGM，1989)。关于运点，例如 大麦黄矮病毒或马铃馨卷叶病毒的病毒传播是主要的因素。
[0004] 化学试剂，如化虫嘟和乐果在传统植物生产中用于晒虫防治，而来自尼姆树的印 棟素用于生物学植物生产(http://WWW,profiflor,de/index.htm) 〇晒虫防治的另一种方 法是使用益虫（食晒蛹、瓢虫、褐略），但该方法仅适于溫室种植，并会造成物种入侵现象。 然而，杀虫剂的使用仍是最重要的晒虫防治机制，但在过去几年中，由于对环境潜在的负面 影响，可信赖的杀虫剂的数量降低。杀虫剂另一个问题是除了许多其他昆虫物种之外，晒虫 出现抗性。瓜和棉花晒虫棉晒（Aphisgossypii)对41种活性化合物出现抗性，碧桃晒虫 桃晒（Myzuspersicae)已对 74 种化合物出现抗性(http: //www.pesticideresistance. com/)。杀虫剂抗性在一代之后就能够出现，并在全世界不同的晒虫品种和群体中均有报 道。
[0005] 为了防止杀虫剂负面的环境效应，并降低抗性发展的风险，开发了病虫害综合治 理策略（IP巧W使农药（杀虫剂和除草剂）的用量最小化。例如根据"Gutefachliche Praxis",IPS对于德国农业是强制性的，并且要求使用生物学、生物技术和植物育种方法W 及农业栽培方法。IPS被联合国确认为植物保护的通用原则。
[0006] 为了降低杀虫剂的用量，基于IPS开发了新的生物技术方法W防治农业中的害 虫。运些方法中的一种是RNA干扰的使用。对于晒虫，一些出版物中通过向血淋己中注射 dsRNA或siRNA(MuttiNSetal.，2006Jaubert-PossamaiSet日1.，2007)，或者人工喂 食dsRNA(ShakesbyAJetal.，2009;怖yardSetal.，2009)，实现了RNAi-介导的基因 沉默。
[0007] 转基因植物向其晒虫宿主递送高特异性dsRNA的概念由PitinoΜetal. (2011) 首次证实。作者选择rackl(肠定位）和c002 (唾液腺定位）作为碧桃晒虫桃晒的两个不 同的基因勒1标。两种不同的植物，烟草（Nicotianabenthamiana)和拟南芥（Ar油idopsis thaliana)转化每种祀标，每个基因改造的植物品种均观察到高达60%的晒虫沉默效果。 作为基因沉默的结果，作者描述了两种基因均造成生殖力降低。令人惊讶的是，与之前在魏 豆晒（A巧；rthosi地onpisum)的体外实验（MuttiNSetal.,2006)中观察到的不同，C002 的沉默并不影响生存。作者认为该区别源于不同的物种。
[0008] 由于大多数植物被多于一种害虫侵扰，需要一种在不同物种之间效力不存在差异 的方法。
[0009] 因此，提供一种用于不同害虫种类的，改善的害虫防治方法将是非常有利的。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明设及包括将针对结构性銷蛋白（SH巧的抑制剂渗入表达甜P蛋白的农业目 标害虫体内的多种类害虫防治方法，该SHP蛋白存在于多种半翅目种中。
[0012] 本发明特别设及RNAi介导的銷蛋白SHP沉默的两种方法，用于防治吸食植物 的半翅目昆虫，特别是农业中的胸瞭亚目（suborderSternorrhyncha)和蜡赠子亚目 (infraorderFulgoromorpha)群体。
[0013] 在第一方面，本发明的实施方案提供新的害虫防治方法，包括将针对结构性銷蛋 白（SH巧的抑制剂渗入农业目标害虫体内。
[0014]在第二方面，本发明的实施方案设及选自W下组的分离的多核巧酸：
[001引a)包含选自沈QIDN0:1、SEQIDN0:5和沈QIDN0:7的核酸序列的多核巧酸； [001引b)与选自沈QIDN0:1、沈QIDN0:5和沈QIDN0:7的核酸序列在严格条件下 杂交的多核巧酸；
[0017] C)与选自沈QIDNO: 1、SEQIDNO:5和沈QIDNO:7的核酸序列具有至少70%、 至少80%、至少85%、至少90%序列相同性的多核巧酸；
[001引d)选自沈QIDN0:1、沈QIDN0:5和沈QIDN0:7的核酸序列的至少16个连续 核巧酸的片段；W及
[001引e)序列（a)、化）、（C)或（d)的互补序列（complementofthesequence)，
[0020] 其中半翅目的作物、溫室和/或观赏植物的害虫消化包含与所述多核巧酸或所述 片段互补的至少一条链的双链核糖核巧酸序列，W降低所述害虫的进食。
[0021] 在第Ξ方面，本发明的实施方案设及由根据本发明的多核巧酸表达所产生的双链 核糖核巧酸序列，其中由半翅目作物植物的害虫消化所述核糖核巧酸序列，W降低所述害 虫的进食。
[0022] 在第四方面，本发明的实施方案提供包含第二方面的核酸分子的载体或表达系 统，W及由所述载体转化、转导或转染的细胞。
[0023] 在第五方面，本发明的一些实施方案设及用本发明的多核巧酸转化的植物，或该 植物包含所述多核巧酸的种子。
[0024] 另外，一些实施方案设及由第五方面的植物产生的商品产品，其中所述商品产品 包含可检测量的第二方面的多核巧酸或由其表达的核糖核巧酸。
[0025] 在第六方面，一些实施方案提供用于控制半翅目害虫侵扰的方法，包括：在半翅目 害虫的食物中提供包含第一多核巧酸的试剂，其在被害虫消化时会起作用，W抑制所述害 虫中的生物学功能，其中所述多核巧酸序列与来自所述害虫的甜P编码序列在至少约16至 约25个连续核巧酸上显示约95%至约100%的核巧酸序列相同性，并与和所述第一多核 巧酸序列互补的第二多核巧酸序列杂交，并且其中来自所述害虫的所述甜P编码序列选自 沈QIDNO: 1、SEQIDNO:5和沈QIDNO:7或其互补序列。
[0026] 另外，在第屯方面，本发明的实施方案设及控制半翅目害虫侵扰的方法，包含提 供表达本发明的多核巧酸序列的植物细胞，其中所述多核巧酸表达产生双链核糖核酸 (ribonucleicacid),其中所述双链核糖核酸（ribonucleotideacid)和/或来自所述双 链核糖核酸（ribonucleotideacid)的RNAi诱导化合物被所述害虫消化时抑制SHP编码 目标序列在所述害虫中的表达，并导致对所述食物的进食相对于缺少所述植物细胞的食物 减少。
[0027] 另外，在第八方面，本发明的实施方案设及对受到昆虫害虫（insectpest)侵扰的 作物植物所产生的作物产量进行改善的方法，所述方法包括W下步骤：
[0028]a)将本发明的多核巧酸导入所述作物植物，
[0029]b)培养所述作物植物W使所述多核巧酸表达，其中所述多核巧酸的表达抑制昆虫 害虫的进食W及由于昆虫害虫侵扰导致的产量损失。
[0030] 在另一个方面，本发明设及转基因植物，其包含对目标害虫的SHP的抑制剂进行 编码的基因。
[0031] 在对本发明进行详细描述之前，应当理解本发明不限于所述方法处理步骤的具体 组成部分。还应当理解，本文所用术语仅是为了描述具体的实施方案，无意于限制。应当注 意的是，除非文中另有明确说明，说明书和所附权利要求书中所用的单数形式"一种（a)"、 "一种（an)"和"运种（the)"包括单数和/或复数指代。还应理解的是，对于由数值限定的 参数范围，该范围视为包括运些限定值。
【附图说明】
[003引图1代表电子显微镜图化示出甜P沉默对銷形成的影响。
[003引图2是两个示意图，示出甜PRNAi晒虫做和对照（A)的行为巧PG波型）的时 间演化。
[0034] 图3是示意图，示出重要的非初皮部和初皮部EPG波型百分比。
[0035] 图4是两个示意图，示出SHPRNAi晒虫和对照的生殖。
[0036] 图5是不意图，不出通过卡普兰-迈耶化apianMeier)Log-Rank进行的甜PRNAi 晒虫和对照的生存分析。
[0037] 图6是核酸序列，示出编码魏豆晒甜P的mRNA序列（SEQIDNO. 1)的一部分。
[003引 图7示出来自SEQIDNO. 1的dsRNA的核糖核酸序列（SEQIDNO. 2)，示例性地用 于体外和活体内的魏豆晒害虫防治。
[0039] 图8示出部分质粒载体图谱，其中来自p71-Ubi-RNAi载体的GUS被shp模板（图 7)取代，产生p7iUbi-shp-RNAi。
[0040] 图9是示意图，示出在进食对照植物（wt-野生型；ev-空载体）和表达shp-dsRNA 的植物的晒虫种麦长管晒（Sitobionavenae)中通过qRT-PCR对shp转录子进行定量。（a) 在进食L26、ev和wt品系2周后的shp转录子相对定量。与进食wt和ev对照的晒虫相 比，进食shp-dsRNA植物品系L26的晒虫中shp表达的降低具有统计学显著性。化）进食 shp-dsRNA品系2周并随后进食wt1周或2周后，shp转录子的量。与对照相比，进食L26 的晒虫中shp的表达降低具有统计学显著性。条代表Ξ次独立的样品采集的平均值+标 准差。
[0041]图10示出shp沉默对麦长管晒唾液銷（salivary sheath)形成的影响。来自进 食野生型（a)和空载体化）对照两周并进食人工食物两天的晒虫的唾液銷示出典型的项链 结构（比较图1)。（C)来自进食shp-dsRNA植物品系L26两周的晒虫的唾液銷形成在人工 食物中被破坏。
[004引图11是示意图，分别示出在侵扰期间进食对照（wt-野生型；ev-空载体）和表达shp-dsRNA的植物的麦长管晒的生殖。每组含有15只晒虫。（左）SHPRNAi晒虫示出比进 食对照植物品系的晒虫更低的生殖率和更短的生殖持续时间。（右）SHPRNAi晒虫的总生 殖显著低于对照组的总生殖。
[004引图12是示意图，示出来自进食对照（wt-野生型；ev-空载体）和表达shp-dsRNA的植物的麦长管晒的生存天数（dai)-侵扰后天数示出）。通过卡普兰-迈耶Log-Rank 进行存活分析。每组含有15只晒虫。与对照相比，进食表达shp-dsRNA的植物的晒虫未示 出存活率降低。
【具体实施方式】
[0044] 本发明设及包括将针对结构性銷蛋白（SHP)的抑制剂渗入农业目标害虫体内的 新的害虫防治方法，特别是针对属于半翅目，如晒虫的昆虫害虫，W及用于该方法的害虫防 治试剂，W及转基因作物、溫室和观赏植物。
[0045] 另外，本发明提供用于害虫侵扰的遗传防治方法和组合物。例如，本发明提供重 组DNA技术，所述技术通过给害虫喂食转录于所有或部分目标编码序列的一或多种双链 RNA(dsRNA)和/或小干扰核糖核酸（siRNA)分子，W在转录后抑制或限制目标结构性銷蛋 白（SH巧编码序列在害虫细胞中的表达，从而提供害虫防治效果，由此防治侵扰。因此，本 发明设及使用双链RNA(dsRNA)，包括小干扰核糖核酸（siRNA)，来序列特异性抑制SHP编码 序列的表达，W获得预期的害虫防治水平。
[0046] 本发明提供分离和基本纯化的核酸分子，其包括但不限于用于转录本发明的 dsRNA分子的非天然存在的核巧酸序列和重组DNA构建体，当其导入害虫时，抑制或限制结 构性銷蛋白（SHP)目标编码序列在害虫中的表达。本发明还提供转基因植物，（a)含有核 巧酸序列，该核巧酸序列编码分离和基本纯化的核酸分子W及用于转录dsRNA分子，W防 治植物害虫侵扰的非天然存在的重组DNA构建体，化及化）显示对害虫侵扰的抗性和/或 增强的耐受性。本发明还提供含有本发明的dsRNA核巧酸序列的组合物，用于在植物、动物 或动物环境中的局部施用，W实现害虫侵扰的消除或减少。
[0047] 令人惊讶的是，发明人发现抑制甜P是害虫防治的普遍适用形式。例如，生产转基 因植物，其表达祀向特定昆虫害虫中的甜P的dsRNA，是减少昆虫害虫对农业影响的有效且 环境可持续的方式。
[0048]SHP负责唾液銷的硬化，所述唾液銷是一种蛋白结构，由在整针（stylet)移动期 间分泌入植物组织的凝胶唾液形成（Tjallingiiand化genEsch，1993)。发明人的方 式基于W下发现：唾液銷存在于许多害虫品种，特别是许多属于半翅目如晒虫的品种。例 如，唾液銷存在于所有目前已研究的晒虫中，具有高度相似性的序列见于桃晒EST数据 库中巧ST登录号EC387934、EC388457 和邸572212 (http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/))。 麦长管晒和麦无网长管晒（Metopolophiumdirhodum)据报道有99%的mRNA巧efSeq XM001943863 (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/))高度序列重叠（RaoSAK(2011)"The identific曰tion曰ndch曰r曰cteriz曰tionofs曰livaryproteinsfromthecere曰1 曰phids Sitobion曰ven曰e,MetopolophiumdirhodumandRhop曰losiphump曰di"，博：t论文，都柏 林大学，爱尔兰）。
[0049] 除了晒虫，在属于半翅目，包括胸瞭亚目的其他昆虫群体例如粉風（化eemanet al. , 2001)和飞風（蜡赠子亚目）度rentassietal. , 2007)中，也观察到銷样结构的形成。 胸瞭亚目和蜡赠子亚目两姐妹群中显示可能来自共同始祖的甜P蛋白的蛋白序列重叠。
[0050] 发明人发现昆虫中甜P的沉默，例如其通过注射特异性双链RNA被诱导，将阻止銷 硬化。运导致与对照组相比较迟且减缓的进食W及显著降低的生殖率（-50%)。可W想 象，进食减缓由于降低昆虫，特别是晒虫造成的营养流失（removalofnutrition),会降低 对植物发育的负面影响。另外，进食减缓会降低感染晒虫传播的植物病毒，如大麦黄矮病毒 感染的风险。生殖下降也会导致缓慢的群体生长，其使得例如单个晒虫更容易被捕食者如 瓢虫捕获。
[0051] 本发明的结果表明编码甜P的核巧酸序列值NA或RNA)可用于构建抗害虫侵扰的 植物细胞。害虫宿主例如可被转化而含有一或多个编码SHP的核巧酸序列。转化入害虫宿 主或共生生物的核巧酸序列可编码一或多个RNA，其在转化的宿主或共生生物的细胞或生 物体液中形成dsRNA序列，由此如果/当害虫进食转基因宿主或共生生物时，dsRNA出现在 害虫的食物中，导致害虫细胞中甜P表达的抑制及害虫最终的死亡、生长迟缓或其他抑制。
[0052] 转录后基因沉默可用于下调SHP编码基因的表达。所述基因沉默可例如通过反义 分子或介导RNA干扰的分子实现。
[0053] 反义多核巧酸设计为特异性结合RNA，导致RNA-DNA或RNA-RNA杂种的形成，并阻 止反转录或信使RNA翻译。已开发了许多形式的反义分子，其可宽泛地分为酶依赖型反义 分子或空间阻抑型反义分子。酶依赖型反义分子包括依赖RNaseΗ活性降解目标mRNA的 形式，包括单链DNA、RNA和硫代憐酸醋反义分子。反义多核巧酸通常在细胞内经反义构建 体表达产生，所述反义构建体包含作为被转录链的反义链。反义多核巧酸会结合和/或干 扰相应mRNA的翻译。反义RNA或反义寡脱氧核巧酸（反义0DN)均可使用，并且还可经体 外合成或通过重组DNA技术制备。为了避免被DNAse消化，0DN和反义RNA可经化学修饰。 反式切割催化性RNA(核酶）是具有内切核糖核酸酶活性的RNA分子。核酶根据特定目标 特异性设计，目标信使必须含有特异性核巧酸序列。它们被设计为在细胞RNA背景下位点 特异性切割任意种类RNA。该切割事件使得mRNA不稳定，并阻止蛋白表达。
[0054] 在其他有利的实施方案中，用于在转录后水平降低SHP表达的方法基于RNA干扰 (RNAi)。通过RNAi下调基因的方法是本领域技术人员熟知的，因此在此无须寶述。可用于 敲低SHP编码基因表达的RNAi诱导化合物的实例包括但不限于短干扰核酸（siNA)、短干扰 RNA(siRNA)、microRNA(miRNA)、短发卡RNA(shRNA)及其前体，所述前体在细胞中经加工成 为实际的RNAi诱导化合物。根据一个实施方案，siRNA用于沉默。siRNA可W是在每条链 具有3'突出端的双链分子。也可使用平末端分子。所述siRNA可包括脱氧及核糖核巧酸， 并且可进一步包含修饰的核巧酸。siRNA化合物的几个实施方案和变体是现有技术中已知 的，并且可用于降低甜P基因的表达。为了有效诱导沉默，用作RNAi诱导化合物的siRNA 与目标基因转录物的部分实质上互补，通过RNA干扰抑制所述基因表达。
[0055] 本发明大体设及对属于半翅目的害虫侵扰宿主生物体的遗传控制。更具体地，本 发明包括向晒虫害虫递送害虫防治试剂的方法。所述害虫防治试剂直接或间接破坏所述害 虫自我维持、生长或侵扰目标宿主或共生生物的能力。本发明提供在害虫食物中使用稳定 的dsRNA分子抑制害虫中编码甜P的目标基因，由此在由害虫祀向的宿主或共生生物内或 周边实现期望的害虫侵扰防治。
[0056] 为了实现上述发明，本发明提供在昆虫害虫，特别是属于半翅目的昆虫，包括属于 胸瞭亚目和/或蜡赠子亚目的昆虫，特别是如魏豆晒的晒虫中抑制甜P编码目标基因的表 达的方法，其导致害虫进食、生长、发育、生殖、侵扰的终止，并最终导致害虫死亡。
[0057] 在一个实施方案中，所述方法包括将部分或全部稳定的双链RNA(dsRNA)核巧酸 分子导入害虫作为食物来源的营养组合物中，并使所述营养组合物供害虫进食。对含有双 链或SiRNA分子的营养组合物的摄食消化导致该分子被害虫细胞摄取，导致害虫细胞中至 少一种目标基因的表达被抑制。对目标基因的抑制给害虫造成了有害的效应。
[0058] 在某些实施方案中，本发明提供的dsRNA分子包括与SEQIDNO: 1中所含核酸序 列互补的核巧酸序列，在害虫生物体中对所述核酸序列的抑制造成甜P的降低或去除。选 用的核巧酸序列与SEQIDNO: 1，包括其互补序列的16-25个连续核巧酸具有约80% -至 少约100%的序列相同性。该抑制是特异性的，因为选择来自SHP编码目标基因的部分的核 巧酸序列，抑制性dsRNA或SiRNA由此转录。所述方法有效抑制SHP目标基因的表达，并能 用于抑制许多不同类型的害虫。在一个具体实施方案中，所述核巧酸序列是SEQIDN0:2。
[0059] 在有利的实施方案中，经鉴定具有害虫防治效果的核酸序列可通过构建适当的 表达构建体而很容易地表达为dsRNA分子。例如，该序列可表达为发卡和颈环结构，其 具有对应于SEQIDNO: 1或其片段的第一区段，将该序列与和第一区段不同源或互补 的第二区段间隔区连接，并将其与转录RNA的第Ξ区段连接，其中所述第Ξ区段的至少 一部分与第一区段实质上互补。该构建体通过第一区段与第Ξ区段的杂交形成颈环结 构，并形成包含第二区段的环结构（W094/01550,W098/05770,US2002/0048814A1，W及 US2003/0018993A1)〇
[0060] A.定义
[0061] 本发明所用"细胞"、"细胞系"和"细胞培养物"可互换使用，所有运些名称均包括 后代。因此，术语"转化体"或"转化细胞"包括原代受试细胞和来源于此的培养物，不考虑 转化的次数。还应理解，由于有意或无意的突变，所有后代的DNA含量并不完全相同。还包 括筛选得到的与原始被转化细胞具有相同功能性的突变后代。
[0062]用在本文，术语"编码序列"（"codingsequence"或"encodingsequence")、"结 构性核巧酸序列"或"结构性核酸分子"是指置于适当的调控序列控制下时，翻译成多肤（通 常通过mRNA)的核巧酸序列。编码序列的界限由5'末端的翻译起始密码子和3'末端的翻 译终止密码子确定。编码序列可包括，但不限于，基因组DNA5cDNA、EST和重组核巧酸序列。
[0063] 用在本文，术语"互补"是指两个核酸序列之间的关系。如果一种核酸序列能与 第二种核酸形成双链体，其中所述双链体的每个残基形成鸟巧-胞巧（G-C)或腺巧-胸巧 (A-T)碱基对或等同的碱基对，则该核酸序列与该第二种核酸序列互补。等同的碱基对可包 括除鸟巧、胞巧、腺巧或胸巧之外的核巧或核巧酸类似物。
[0064] 用在本文，术语"衍生物"是指与请求保护的序列之一的核酸分子具有相似的甜P 目标核酸序列结合特性的核酸分子。
[0065] 用在本文，术语"衍生自"是指可由具体的特定来源或物种获得的特定的核巧酸序 列，尽管不必直接来自于该特定来源或物种。
[0066] 术语"表达克隆"是指含有期望的编码序列及可操作连接的控制序列的DNA序列， 由此用该序列转化的宿主能够产生编码的蛋白。术语"表达系统"是指用表达克隆转化的 宿主。为了实现转化，表达克隆可包含在载体上，然而，相关的DNA也可整