一种固液相结合法制备卡贝缩宫素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种固液相结合法制备卡贝缩宫素的方法。
【背景技术】
[0002] 卡贝缩宫素，英文名称为Carbetocin，是由加拿大辉凌制药（FerringInc.)研发 合成的具有激动剂性质的长效催产素九肽类似物，于2009年在中国上市。其结构如下：
[0003]
[0004] 卡贝缩宫素用于选择性硬模外或腰麻下剖腹产术后，以预防子宫收缩乏力和产后 出血。像催产素一样，卡贝缩宫素与子宫平滑肌的催产素受体结合，引起子宫的节律性收 缩，在原有的收缩基础上，增加其频率和增加子宫张力；在非妊娠状态下，子宫的催产素受 体含量很低，在妊娠期间增加，分娩时达高峰；因此卡贝缩宫素对非妊娠的子宫没有作用， 但是对妊娠的子宫和刚生产的子宫具有有效的子宫收缩作用。
[0005] 目前，卡贝缩宫素的制备方法国内外已广为报道：西班牙专利ES2115543公开了 一种卡贝缩宫素的制备方法：以Fm〇C-Cys(Trt)-0H，氯丁酸为原料合成卡贝缩宫素线性肽 树脂，裂解后得线性肽，然后将其溶解在溶液中，通过Na0H/Li0H/DIEA/DMAP/NaHC03等碱性 试剂环化得卡贝缩宫素；该方法采用纯固相合成卡贝缩宫素线性肽，成本较高，且粗肽样品 纯度较低。
[0006] 另外，捷克专利CS8605461公开了一种通过固相法合成Z-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl) -Pr〇-Leu-Gly-NH2线性肽，氢化得到Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2再与溴丁酸反应， 进而环化得到卡贝缩宫素，此方法中的由于存在氢化操作，安全风险大，不适于工业化生 产。
[0007] 在国内，专利CN104262464A、CN102796178A、CN104086631A、CN101555272 B与CN102260326AXN103467573A分别公开了一种先以固相法合成卡贝缩宫素线性肽树 月旨，然后固相上进行环合反应，该类方法在固相合成过程中容易产生甘氨酸缺失肽杂质，且 一般采用氨基树脂，生产成本高，不适宜大规模生产。
[0008] 在中国专利CN103833831A-种片段法固相合成卡贝缩宫素的方法中，采用的方 法是首先合成片段 1 肽树脂Br(CH2) 3-C0-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Cys-Wangresin与片段 2肽树脂H-Pro-Leu-Gly-Rinkamide-AMresin，然后片段1肽树脂经环化、裂解过程再连 接到片段2上，再次裂解后可制得卡贝缩宫素，此方法需采用两种固相载体，并且经过两步 裂解过程，生产成本高，不利于放大生产。
[0009] 中国专利CN102477082A公开了一种纯液相法合成卡贝缩宫素的方法：在液相 中先分别合成三个卡贝缩宫素中间体片段，然后再将三个片段连接形成卡贝缩宫素线性 肽，再进行环化反应，制备卡贝缩宫素，该方法涉及多种中间体，步骤繁琐，操作不便，不利 于放大生产。
[0010] 综上所述，目前报道的卡贝缩宫素合成方法中单纯采用固相合成法容易产生甘氨 酸缺失肽杂质，样品提纯困难，并且需要使用价格昂贵的氨基树脂作为原料进行肽链或片 段的合成，生产成本较高，不适宜大规模生产；而在纯液相法合成卡贝缩宫素的方法中存在 中间体过多，反应后处理工作繁琐，操作不放便的问题，也不利于进行放大生产问题。
【发明内容】
[0011] 为解决卡贝缩宫素上述合成过程中存在的问题，本发明提供一种固液相结合法制 备卡贝缩宫素的方法：首先米用固相合成法制备得片段(CH2) 3-C0_Tyr(Me) -Ile-Gln-As n-Cys-〇H，再与以液相法制得的片段H-Pr〇-Leu_Gly-NH2，随后进行偶联反应，得到卡贝缩 宫素线性肽，最后在液相中进行环化制得卡贝缩宫素。此法操作过程简便，生产成本低，并 且能够避免甘氨酸缺失肽杂质的产生，有利于后续的纯化过程，适宜大规模生产。
[0012] 为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0013] -种固液相结合法制备卡贝缩宫素的方法，包括如下步骤：
[0014] (a)以Wangresin或CTCresin为固相载体，用Fmoc-Cys(Trt)-0H与之偶联 反应制备Fmoc-Cys(Trt)-Wangresin或Fmoc-Cys(Trt)-CTCresin，再按序列依次偶 联保护氨基酸Fmoc_Asn(Trt)-〇H、Fmoc_Gln(Trt)-〇H、Fmoc-Ile-OH、Fmoc_Tyr(Me)-〇H、 X(CH2) 3-C00H，得片段I肽树脂，经裂解反应，制得片段I，其结构如下：
[0015] X- (CH2) 3-C0-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-〇H
[0016] (b)以Boc-Pro-OH、H-Leu-〇H、HOSu和DCC为原料，液相中反应制备 Boc_Pr〇-Leu-〇H〇
[0017] (c)以Boc-Pro-Leu-OH、H-Gly-NH2 ·HC1、HOSu和DCC为原料，液相中反应制备 Boc-Pr〇-Leu_Gly-NH2,脱除Boc后制得片段II，其结构如下：
[0018] H-Pr〇-Leu-Gly-NH2
[0019] (d)片段I与片段II进行偶联反应，制得卡贝缩宫素线性肽，其结构如下：
[0020] X- (CH2) 3-C0-Tyr (Me) -Ile-Gln-Asn-Cys-Pr〇-Leu-Gly-NH2
[0021] (e)卡贝缩宫素线性肽经环化反应，制得卡贝缩宫素，其结构如下：
[0022]
[0023] 其中步骤（a)中：固相载体为替代度为0. 6-1. 2mmol/g的Wangresin或CTC resin;Fmoc_Cys(Trt)-Wangresin或Fmoc-Cys(Trt)-CTCresin脱除Fmoc保护后，以 2-5 倍的投料比加入相应的保护氨基酸进行偶联反应，每一个偶联反应均是在缩合剂的存在下 进行的固相接肽反应，每一步偶联反应均以Kaiser试剂检测反应终点，反应完毕后用脱保 护试剂脱除Fmoc，再与下一个保护氨基酸进行偶联反应；重复操作直至合成得到侧链全保 护的片段I肽树脂。
[0024] 优选的，步骤（a)中，裂解反应所用的裂解试剂为加入体积比1-5%清除剂的TFA 溶液，清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水和TIS中的一种或几种；更 为优选的裂解试剂配比为：TFA/EDT/苯甲硫醚/水/苯酚=82. 5/5/5/5/2. 5 ;X(CH2)3-C00H 中的X为Br或Cl;缩合剂为以下组合DIC/H0Bt、DIC/H0At、TBTU/H0Bt/DIPEA、HBTU/H0Bt/ DIPEA、HATU/H0At/DIPEA中的一种；脱保护试剂是20%哌啶/DMF。
[0025] 其中，步骤（b)中，Boc-Pro-Leu- 0H的制备过程为：将H-Leu-〇H与碱A按照摩 尔比1:1~2的比例溶解在水中，加入5~20 %体积比的有机溶剂助溶。完全溶解后，冰 水浴中，搅拌下将用有机溶剂溶解的Boc-Pro-OSu溶液滴加到H-Leu-OH的溶液中，其中 H-Leu-〇H的摩尔量为Boc-Pro-OSu的1. 1~1. 5倍。TLC监测反应终点。待反应结束后， 减压浓缩除去有机溶剂，抽滤后，冰水浴下以10%的柠檬酸水溶液将反应液pH值调至2~ 3,乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩至原液的1/2体积，加入等 体积石油酿，析晶，抽滤，真空干燥，得Boc_Pr〇-Leu-〇H。
[0026]Boc-Pro-OSu的制备过程为：Boc-Pr〇-0H和HOSu按照1:1. 0-1. 2的摩尔比溶 于有机溶剂中，冰水浴下将1. 0-1. 2倍Boc-Pro-OH摩尔量的DCC/有机溶剂溶液滴加到 Boc-Pro-OH/HOSu溶液中，lh内滴加完毕，撤冰水浴，25°C继续搅拌反应2h;反应完成后抽 滤，滤液减压浓缩至总体积的1/3-2/5,抽滤，向滤液中加入其3-4倍体积的石油醚，析出 白色固体，抽滤，滤饼以乙酸乙酯重新溶解至浓缩后体积，加入3-4倍体积石油醚，析晶，抽 滤，真空干燥滤饼，得Boc-Pr〇-〇Su。
[0027]其中，步骤（c)中，H-Pr〇-Leu-Gly-NH2的制备过程为：将H-Gly-NH 2·HC1与碱A 按照摩尔比1:1~2的比例溶解在水中，加入5~20%体积比的有机溶剂助溶。完全溶解 后，冰水浴中，搅拌下将用有机溶剂溶解的Boc-Pro-Leu-OSu溶液滴加到H-Gly-NH2·HC1 的溶液中，其中H-Gly-NH2·HC1的摩尔量为Boc-Pro-Leu-OSu的1. 1~1.5倍，TLC监测 反应终点。待反应结束后，减压浓缩除去有机溶剂，抽滤后，冰水浴下以10%的柠檬酸水 溶液将反应液pH值调至2~3,乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓 缩至原液的1/2体积，加入等体积石油醚，析晶，抽滤，真空干燥得Boc-Pro_Leu-Gly-NH2; 然后用50 %的TFA/H20溶液将其溶解，搅拌反应lh，甲叔醚沉降并洗涤2次，真空干燥，得 H-Pr〇-Leu-Gly-NH2。
[0028]Boc-Pro-Leu-OSu的制备过程为：Boc-Pr〇-Leu-0H和HOSu按照 1:1. 0-1. 2 的摩尔 比溶于有机溶剂中，冰水浴下将1.