一种适用于根部接种的稻瘟病菌菌株y4及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种适用于根部接种的稻瘟病菌菌株Υ4 及应用。
【背景技术】
[0002] 稻瘟病是一种在水稻上发生的世界性真菌病害，严重影响水稻生产和粮食安全。 据报道，全球每年因稻瘟病造成的水稻产量损失约占总产量的10~15%，经济损失达数十 亿美元；在我国，稻瘟病每年都有不同程度发生，特别是近几年，在西南、长江中游和东北等 稻作区持续大发生，年发病面积达330~570万公顷，损失稻谷数亿公斤，给我国水稻安全 生产带来了巨大隐患（刘占领等，2007;郑钊等，2009)。目前在大多数情况，仍然依靠传统 的化学药剂和种植抗病品种来控制该病害，但效果并不是很理想。加之人们对食品安全的 日益重视及环保意识的逐渐加强，化学药剂的使用已不再是现代农业生产上首推的防治措 施；受病原菌小种遗传的复杂性、致病多样性及极易变异性三方面因素影响，导致新的抗病 品种常常推广数年后便失去抗性（Skamni〇ti&Gurr，2009)。因此，发展稻瘟病持续、环境友 好的防治措施需要对稻瘟病的病害侵染、发生和成灾过程有一个更加深入系统的了解。
[0003] 稻痕病菌（Magnaportheoryzae)作为一种传统的"气传"病原真菌，被划归于巨 座壳科（Magnaporthaceae)，而巨座壳科真菌除稻痕菌外还包括典型的土传病原真菌，如小 麦全蚀病菌Gaeumannomycesgraminis、草坪夏季斑枯病菌M.poae和小麦根部侵染病原 M.rhizophila(Cannon，1994)。18S和28SrDNA等聚类分析结果表明，稻瘟病菌与以上土传 病菌均可聚为一类，亲缘关系较为接近（Cannon, 1994;Thongkanthaetal.，2009)。Sesma 和Osbourn(2004)报道稻瘟病菌可在菌丝上形成简单的膨大附着枝侵入水稻根部，2~4周 后在根、茎、叶、穗部位可观察到典型的稻瘟病斑，虽然症状出现时间与分生孢子侵入地上 组织相比较慢，但这已说明M.oryzae可通过根部系统侵染水稻引起全株发病。因此稻瘟菌 除经气传侵染外，在田间还可能由水稻根部侵染，在植株地上部分引起典型的稻瘟病症状。 由此，推测稻瘟病可能在田间也兼顾土传病害的侵染、流行特点。尽管如此，在已有研究中， 研究者在室内对稻瘟病菌根部接种发病率很低，平均发病率仅10%左右，这极大的限制了 关于稻瘟病菌对水稻根部侵染机制的深入研究。鉴于此，有必要弄清不同条件对稻瘟病根 部侵染发病的影响，建立稻痕病菌根部接种体系，打破制约稻痕病致病机制深入研究的技 术瓶颈。
[0004] 因此在室内完善稻瘟病的人工接种条件，建立起一套稳定高效的稻瘟病根部接种 技术体系，已成为现今研究的一项重要任务。而植物病原真菌侵染寄主的关键在于其本身 的致病力以及侵染的环境条件，所以本发明以一株强致病力的稻瘟菌株作为出发菌株，构 建稳定地稻瘟菌绿色荧光标记菌株作为研究对象；围绕这个菌株研究并建立了一套高效稳 定的稻瘟菌根部接种体系。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一种适用于根部接种的稻瘟病菌菌 株Y4,该菌株已于2015年10月8号送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：稻瘟菌 (Magnaportheoryzae)Y4,保藏编号：CCTCCN0:M2015592,地址：中国武汉武汉大学。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供了一种适用于根部接种的稻瘟病菌菌株Y4的应 用，利用该病菌选择合适的环境参数对水稻进行侵染，解决了目前稻瘟病根部接种发病率 不稳定这一难题。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0008] -种适用于根部接种的稻瘟病菌菌株Y4的获得：
[0009] 将稻瘟菌野生型菌株和含有质粒pCAMsgfp农杆菌的頂培养液混合培养，挑取单 菌落于含潮霉素50μg/ml的PDA平板上，28 °C下培养5d(重复3次），对转化子进行生理生 化特性的鉴定，最终获得了一株高效稳定的稻瘟病菌Y4,在普通光学显微镜和荧光显微镜 下观测分生孢子形态，分生孢子发绿色荧光，洋梨形或倒棍棒形，顶端钝尖，基部钝圆，有脚 胞，与野生型菌株相比，在孢子形态上没有差异，呈典型稻瘟病菌分生孢子特征。每平方厘 米的产孢量可达到9. 43X105个/ml，孢子萌发率为98 %。
[0010] 该菌株已于2015年10月8号送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：稻瘟 菌（Magnaportheoryzae)Y4,保藏编号：CCTCCNO:M2015592,地址：中国武汉武汉大学。一 种适用于根部接种的稻瘟病菌菌株Y4的应用，包括利用该菌株侵染水稻，具体包括以下步 骤：
[0011] 采用菌丝块根部接种法，水稻种子置于〇. 7%的水琼脂培养基上，黑暗28°C保湿 催芽生长，直至幼根生长至5-6cm，将幼根生长健壮的幼苗移至装有35ml蛭石的玻璃管中， 4个菌块放在幼根上，其上用15ml的蛭石覆盖，再加水至蛭石水势为-2Kp，接种后的水稻植 株放置在32°C、16h光照/8h黑暗条件的培养箱中生长。
[0012] 与现有技术相比，本发明具备以下优点：
[0013] 1.通过农杆菌介导（ATMT)遗传转化方法，获得携带GFP标记的抗潮霉素转化子。 对转化子进行致病力、荧光强度以及荧光稳定性的筛选，得到一株致病力强、荧光信号强且 稳定的荧光标记菌株。由于转化子可发绿色荧光，便于跟踪稻瘟菌的侵染过程。
[0014] 2.提供了一种适用于稻痕病菌（Magnaportheoryzae)Y4的稳定高效的稻痕菌根 部侵染方法，为进一步研究稻瘟菌根部侵染机制提供条件，在理论上可在病害循环、发病因 素方面深入认识稻瘟病，在实践应用上，可为稻瘟病防控措施的正确实施提供指导。
【附图说明】
[0015] 图1为培养7天的稻瘟病菌菌株Y4菌落形态示意图；
[0016] 其中图1中a为菌落形态反面，图1中b为菌落形态正面。
[0017] 图2为培养7天的稻瘟菌菌株Y4分生孢子；
[0018] 其中图2中a为明场下观察形态，图2中b为荧光下观察形态。
[0019] 图3为菌丝块接种根部方法示意图。
[0020] 图4为稻痕病菌根部侵染发病不意图；
[0021] 其中图4中a为发病植株整体形态，b为叶部发病部位在明场、荧光条件下观察侵 染情况，c为茎部发病部位在明场、荧光条件下观察侵染情况，d为根部发病部位在明场、荧 光条件下观察侵染情况。
【具体实施方式】
[0022] 本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或材料， 如未特别说明均为公众可获得的。
[0023] 实施例1:
[0024] 稻痕病菌（Magnaportheoryzae)Y4的获得及鉴定：
[0025] 将稻瘟菌野生型菌株和含有质粒pCAMsgfp农杆菌的頂培养液混合培养，挑取单 菌落于含潮霉素50μg/ml的PDA平板上，28 °C下培养5d(重复3次），共筛选出243个转化 子，对转化子进行生理生化特性的鉴定，最终获得了一株高效稳定的稻瘟病菌Y4。将稻瘟 病菌Y4菌丝块，置于PDA平板上，28°C光照条件下培养7天，观察其菌落形态，菌落从中间 到边缘依次是褐色、淡褐色、黑褐色、白色，气生菌丝不发达，呈典型稻瘟病菌菌落特征（图 1)。在普通光学显微镜和荧光显微镜下观测分生孢子形态，分生孢子发绿色荧光，洋梨形或 倒棍棒形，顶端钝尖，基部钝圆，有脚胞，与野生型菌株相比，在孢子形态上没有差异，呈典 型稻瘟病菌分生孢子特征（图2)。每平方厘米的产孢量可达到9. 43X105个/ml，孢子萌 发率为98%。
[0026] 该菌株已于2015年10月8号送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：稻瘟 菌（Magnaportheoryzae)Y4,保藏编号：CCTCCNO:M2015592,地址：中国武汉武汉大学。
[0027] 稻瘟病菌GFP荧光菌株Y4分子鉴定：采用CTAB法