黄芪多糖在骨髓间充质干细胞中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及黄芪多糖在骨髓间充质干细胞中的应用。
【背景技术】
[0002] 骨髓间充质干细胞（bonemesenchymalstemcells,BMSCs)已成为肺癌等肿瘤细 胞学治疗的最佳干细胞之一，但因其在肿瘤环境中可向恶性转化，其安全问题日渐突出。研 究肺癌微环境中BMSCs恶性转化的机制并筛选可预防其恶变的药物日益受到重视。表观遗 传原理与技术已成为探讨肿瘤发生机制及筛选防治肿瘤中药有效部位的重要途径之一。
[0003] 黄芪有补气升阳、益卫固表、利尿消肿、托毒生肌之功效，始载于《神农本草 经》，谓其"主痈疽，久败疮，排脓，止痛，大风癞疾，五痔，鼠痿"，列于上品，是常用补益 药之一。从上世纪70年代开始，人们便开始对黄芪在临床上的应用进行研究。药用 黄苗有两种：豆科植物蒙古黄苗[Astragalusmongholicus(Bge.)Hsiao]及膜荚黄苗 [A.menbranaceus(Fisch.)Bge]的干燥根。其主要有效成分包括黄苗多糖（Astragalus Polysacharin，APS)、黄苗总苷（Astragalosides)、黄酮类、氨基酸等。近年来，国内对其抗 肿瘤作用的研究较为活跃。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了黄芪多糖在骨髓间充质干细胞中的应用，黄芪多糖对骨髓间充质干 细胞具有良好的保护作用。
[0005] 本发明提供黄芪多糖在骨髓间充质干细胞中的应用。
[0006] 作为优选，所述应用为黄芪多糖对骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的保护 作用。本发明还要求保护黄芪多糖在制备保护骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的药 物中的应用。
[0007] 作为优选，所述应用为黄芪多糖在肿瘤环境中对骨髓间充质干细胞的增殖和遗传 稳定性的保护作用。本发明还要求保护黄芪多糖在制备肿瘤环境中保护骨髓间充质干细胞 的增殖和遗传稳定性的药物中的应用。
[0008] 进一步地，所述黄芪多糖的浓度为1-50μg/ml。
[0009] 作为优选，所述应用为黄芪多糖在甲醛环境中对骨髓间充质干细胞的增殖和遗传 稳定性的保护作用。本发明还要求保护黄芪多糖在甲醛环境中保护骨髓间充质干细胞的增 殖和遗传稳定性的药物中的应用。
[0010] 进一步地，所述黄芪多糖的浓度为50-100μg/ml。
[0011] 作为优选，所述应用为黄芪多糖在辐射条件下对骨髓间充质干细胞的增殖和遗传 稳定性的保护作用。本发明还要求保护黄芪多糖在辐射条件下保护骨髓间充质干细胞的增 殖和遗传稳定性的药物中的应用。
[0012] 进一步地，所述黄芪多糖的浓度为1-50μg/ml。
[0013] 本申请还提供黄芪多糖在制备预防骨髓间充质干细胞恶变的药物中的应用。
[0014] 本申请人研究了黄芪提取物黄芪多糖对肺癌微环境诱导下BMSCs细胞形态学、生 长周期、染色体核型变化、CEA等肺癌相关蛋白的表达水平，以及对pl6等肺癌相关基因甲 基化、组蛋白乙酰化、关键基因转录水平等的影响；统计分析BMSCs表观遗传变化与关键基 因转录、癌相关蛋白表达水平的相关性及黄芪提取物的调控作用。揭示BMSCs恶性转化的 能力及其机制，并筛选出可预防其恶性转化的黄芪有效部位，为黄芪联合BMSCs安全有效 地临床应用奠定基础。本申请人还研究了甲醛对BMSCs的增殖和遗传毒性影响，并用黄芪 进行干预，阐明黄芪对甲醛环境中BMSCs的保护作用，不但为甲醛导致白血病的发生提供 生物学依据，而且为甘肃地方中药材的临床应用进一步提供实验依据。同时，本申请人经试 验发现，黄芪多糖对X射线辐射诱发细胞基因组DNA损伤也有防护作用。可见，黄芪多糖 对各种因素造成的骨髓间质干细胞的损伤均具有防护作用，能够作为预防其恶变的药物使 用。
【附图说明】
[0015] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0016] 图1为共培养体系的基本组成示意图；
[0017] 图2为不同浓度APS对BMSCs的增殖率；
[0018] 图3为不同浓度APS对A549细胞的抑制率；
[0019] 图4为共培养后细胞形态变化图；其中，A:BMSCs(100X);B:APS干预组（100X); C：C0-BMSCs(100X)；D：C〇-BMSCs, (oil, 1〇〇〇Χ)Ε：A549 (100X)；
[0020] 图5为各组细胞周期的变化；
[0021] 图6为APS干预共培养后Westernblot结果；
[0022] 图7为APS干预共培养后蛋白相对表达值（7±&,n = 3);其中，**表示与 C〇-BMSCs比较，ρ〈0· 01;NS表示与BMSCs比较，ρ>(λ05 ;
[0023] 图8为WesternBlotting检测各组细胞中HDAC4蛋白表达及相应的柱形图；其 中，A为HDAC4蛋白表达图，B为HDAC4蛋白表达柱形图；
[0024] 图9为WesternBlotting检测各组细胞中组蛋白乙酰化的表达情况；其中，A为 组蛋白H3乙酰化的表达情况；B为组蛋白H4乙酰化的表达情况；
[0025] 图10为Real-TimePCR检测各组细胞中抑癌基因的蛋白表达；其中，A为pl6基 因的蛋白表达；B为p53基因的蛋白表达；HB组即正常对照组hBMSC组，HB-Co组即为模型 对照组Co-hBMSC组；*表示与BMSCs组比较，p〈0. 05 表示与BMSCs组比较，p〈0. 01 ;
[0026] 图11为Real-TimePCR检测各组细胞中肿瘤相关分子的表达；其中，A为Rasgrp2 的表达；B为Wnt5b的表达；C为EGFR的表达；HB组即正常对照组hBMSC组，HB-Co组即为模 型对照组Co-hBMSC组；*表示与BMSCs组比较，p〈0. 05 表示与BMSCs组比较，p〈0. 01 ;
[0027] 图12为小牛胸腺DNA的标准曲线；
[0028] 图13为甲醛对BMSCs的增殖活性影响；其中，*表示甲醛作用组与对照组 (0μmol/L)相比较Ρ〈0· 05 ;** 表示Ρ〈0· 01 ;
[0029] 图14为黄芪对甲醛环境中BMSCs的增殖活性影响；其中，*表示黄芪作用组与对 照组（0μg/ml)相比较Ρ〈(λ05 表示Ρ〈(λ01 ;
[0030] 图15为甲醛对BMSCs形态的影响及黄芪的干预作用；其中，A为对照组细胞形态 (200X)，B为甲醛染毒组细胞形态（400X)，C为黄芪干预组细胞形态（200X);
[0031] 图16为甲醛对BMSCsDNA断裂的影响及黄芪的干预作用；其中，A为对照组彗星 实验（400X)，B为甲醛染毒组彗星实验（400X)，C为黄芪干预组彗星实验（400X);
[0032] 图17为黄芪多糖对辐照后骨髓间充质干细胞的增殖影响，其中，*表示IR与 Control相比，Ρ〈0· 05 表示APS+IR与IR比较，Ρ〈0· 05;
[0033] 图18为荧光显微镜观察X射线照射细胞后0. 5h的y_H2AX免疫荧光簇集点及APS 的保护作用；
[0034] 图19为APS对X射线照射后细胞γ-H2AX荧光焦点数的影响；
[0035] 图20为APS对2GyX射线诱发细胞微核率的影响；其中，*表示IR与Control相 比，Ρ〈0· 05 表示APS+IR与IR比较，Ρ〈0· 05。
【具体实施方式】
[0036] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0037] 实施例1
[0038] -、黄芪多糖抑制肿瘤细胞共培养体系中BMSCs肿瘤相关蛋白表达及其提高遗传 稳定性作用-生物因素
[0039] 1材料
[0040] 1. 1细胞来源
[0041]BMSCs购自CyagenBiosciencesInc.(CatalogNumber:HUXMA_01001; RegistrationNumber:08795844465781) ;A549细胞株购自中国科学院上海细胞研究所 (CatalogNumber:TCHul50);黄芪多糖（简称APS)购自源叶生物科技有限公司，货号 YY91332。
[0042] 2 方法
[0043] 2. 1细胞增殖与毒性实验（MTT比色法）筛选黄芪有效部位、有效浓度
[0044] 2. 2. 1细胞样品的制备取对数生长期未做处理的BMSCs、A549细胞，分别使用含 有10%胎牛血清的01^1作12、01^1培养基配成浓度约为5\10 4个>1的单细胞悬液，接种 于96孔板中，每孔加入100μ1细胞悬液，37°C、5%C02、饱和湿度的细胞培养箱中培养至贴 壁。
[0045] 2. 2. 2药物筛选步骤两组细胞培养至贴壁后分别分组进行药