一种脂肪酶lipaseb5及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化工和生物技术领域，具体涉及一种脂肪酶LIPASEB5及其编码 基因和应用。
【背景技术】
[0002] 脂肪酶（EC3. 1. 1. 3)又称三酰基甘油酯水解酶，能够将甘油三酯水解成甘油和 脂肪酸。在动物、植物及微生物中广泛存在。脂肪酶属于α/β折叠水解酶超家族，催化中 心由丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸组成。脂肪酶能催化水解、醇解、酯化、转酯化等多种化学反 应，是一种最重要的工业生物催化剂，被广泛运用于精细化工、洗涤、医药、食品、造纸、皮革 加工、纺织和饲料工业等领域。从催化特性来看，脂肪酶具有高度的化学选择性和立体异构 选择性，且反应不需要辅酶、反应条件温和、副产物少。在生产应用中的脂肪酶的另一显著 特点是它只能在异相系统（即油-水界面）或有机相中作用。在水相中，脂肪酶通常催化 水解反应的进行，而在有机相中，它却能催化各种合成反应：如酯化、酯的醇解、酯的氨解和 酯的酸解等。然而有机溶剂会使酶变性或使酶活力下降，因此寻找耐有机溶剂的脂肪酶，使 其在有机溶剂或含有机溶剂的环境中具有较高的催化活性。其次，应用于洗涤剂行业的脂 肪酶主要是碱性脂肪酶，在洗涤剂中碱性脂肪酶具有明显的助洗作用。碱性脂肪酶和碱性 蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶及它们的配合物应用于加酶洗涤剂可以减少甚至除去洗涤剂中 的含磷助剂，避免了传统洗涤剂中三聚磷酸钠含量过高而引起江河湖泊产生"过肥化"给生 态环境带来的危害。目前脂肪酶是应用到洗涤剂产业和绿色化工产业中使用最广泛的酶之 〇
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种耐有机溶剂、耐低温的新的脂肪酶LIPASEB5及其编码 基因和应用。
[0004]本发明从海洋放线菌（Pseudonocardiaantitumoralis)SCSI0 01299 中开发得 到一种新的脂肪酶LIPASEB5及其编码基因脂肪酶基因lipaseB5,构建了含有脂肪酶基因 lipaseB5的重组表达载体和基因工程菌，培养基因工程菌后获得脂肪酶LIPASEB5,其可应 用于催化酯类水解反应。
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种脂肪酶LIPASEB5,其氨基酸序列如SEQIDN0.2 所示。
[0006] 本发明的第二个目的是提供一种编码所述的脂肪酶LIPASEB5的脂肪酶基因 lipaseB5〇
[0007] 优选，所述的脂肪酶基因lipaseB5的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 本发明还提供一种含有所述的脂肪酶基因lipaseB5的重组表达载体。所述的表 达载体，优选ρΕΤ-28α(+)载体。
[0009] 本发明还提供一种含有所述的脂肪酶基因lipaseB5的基因工程菌。所述的基因 工程菌，优选大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0010] 本发明的第三个目的是提供所述的脂肪酶LIPASEB5在催化酯类水解中的应用。
[0011] 本发明的第四个目的是提供所述的脂肪酶LIPASEB5在低温、耐受钠盐、短链醇或 表面活性剂环境下进行催化的应用。
[0012] 所述的短链醇为乙醇、正丙醇、异丙醇、仲丁醇或叔丁醇；所述的表面活性剂为 TritonX-100、Tween-80、Tween-20 或十二烷基苯横硫酸钠。
[0013] 本发明的脂肪酶基因lipaseB5来自海洋放线菌（Pseudonocardia antitumoralis)SCSI0 01299(其来源为：120° 0.975'E19。0.6649'N，3258m，pH7.8， 2°C)，保存在中国科学院南海海洋研究所）。本发明利用生物信息学分析方法，从基因组测 序的海洋放线菌（Pseudonocardiaantitumoralis)SCSI0 01299中克隆得到脂肪酶基因 lipaseB5,长度为882bp，编码293个氨基酸。通过克隆脂肪酶基因lipaseB5并将其连接表 达载体pET-28a(+)后转化大肠杆菌BL21 (DE3)，培养并诱导表达后，得到了重组表达的脂 肪酶LIPASEB5。脂肪酶LIPASEB5作为催化剂可催化酯类水解反应，具有较好的稳定性，而 且对表面活性剂及部分有机溶剂的具有很好的耐受性。脂肪酶LIPASEB5的特性符合洗涤 剂添加剂、绿色化工业上对脂肪酶应用上的需求，可用于洗涤剂、生物医药、化妆品和精细 化工等领域。
[0014] 本发明的海洋放线菌（Pseudonocardiaantitumoralis)SCSI001299公开于专利 号：ZL201110231994. 4、发明名称为：一种假诺卡氏菌及利用其制备Deoxynyboquinone的 方法的专利中，本发明的海洋放线菌（Pseudonocardiaantitumoralis)SCSI001299即为 上述专利中的假诺卡氏菌Pseudonocardiasp.SCSIO01299,其于2011年7月18日保藏于 中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCCΝ0:Μ 2011255。
【附图说明】
[0015] 图1是不同侧链长度酰基的对硝基苯酚酯对脂肪酶LIPASEB5酶活的影响。
[0016] 图2是脂肪酶LIPASEB5的最适pH及pH稳定性；OptimumpH为最适pH曲线图， pHstability为pH稳定性曲线图。
[0017] 图3是脂肪酶LIPASEB5的最适反应温度和温度稳定性；A为最适反应温度曲线 图，B为温度稳定性曲线图。
[0018] 图4是不同浓度的NaCl对脂肪酶LIPASEB5酶活性的影响。
[0019] 图5是脂肪酶LIPASEB5的蛋白表达纯化情况；Mark为蛋白Marker，1为IPTG诱 导前的含pET-28a(+) -lipaseB5的大肠杆菌BL21 (DE3)表达的总蛋白对照，2为IPTG诱导 后的含pET-28a(+)-lipaseB5的大肠杆菌BL21 (DE3)表达的总蛋白，3为IPTG诱导后的含 pET-28a(+) -lipaseB5的大肠杆菌BL21 (DE3)细胞上清液，4为纯化的脂肪酶LIPASEB5蛋 白。
【具体实施方式】
[0020] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0021] 本发明的脂肪酶基因lipaseB5来自于基因组测序的海洋放线菌 (Pseudonocardia antitumoralis)SCSIO01299,该菌保存在中国科学院南海海洋研究所 实验室。
[0022] 实施例1:脂肪酶基因lipaseB5引物设计及开放阅读框边界确定
[0023]提取海洋放线菌（Pseudonocardiaantitumoralis)SCSI0 01299 的基因组DNA， 经测序验证无误后，利用生物信息学手段对基因组进行注释，分析其中的脂肪酶基因，确定 了其中脂肪酶基因lipaseB5的开放阅读框，通过信号分析工具http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/分析，发现其5'端含有编码信号肽的90个核苷酸残基，不含信号肽的 脂肪酶基因lipaseB5的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，长度为882bp，其编码的脂肪酶 LIPASEB5的氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示，共293个氨基酸。根据分析得到的脂肪酶基因 lipaseB5序列，设计扩增不含信号肽的肪酶基因lipaseB5的引物序列：上游引物：5^-CAT GGATCCGTGAGCCGACACCTCGATCC-3'(下划线为BamHI酶切位点）；下游引物：5，-CCGCTCGA CTCAGTGTTCCTCGGTGTCGG-3'(下划线为XhoI酶切位点）。
[0024] 实施例2 :脂肪酶lipaseB5的克隆及载体构建
[0025] 2. 1PCR扩增
[0026] 将实施例1设计的引物（上游引物：5，-CATGGATCCGTGAGCCGACACCTCGAT CC-3 '，下游引物：5 ' -CCGCTCGAGTCAGTGTTCCTCGGTGTCGG-3 ')送至上海生物工程有 限公司合成引物，合成的引物使用TE稀释到10μM，提取海洋放线菌（Pseudonocardia antitumoralis)SCSI0 01299的总DNA作为DNA模板，建立如表1所示反应体系：
[0027] 表1 PCR反应体系
[0028]
[0029] 使用以下PCR扩增程序扩增脂肪酶基因lipaseB5 :95°C变性5min;95°C变性 111^11，55~65°(：退火3〇8,72°(：延伸2111丨113〇8，进行35个循环；72°(：延伸1〇111丨11，冷却到 18。。。
[0030] 将？0?产物在0.8%琼脂糖凝胶中，120￥电压下电泳2〇1^11，置于凝胶成像系统中 观察，回收900bp左右的条带。PCR产物按照胶回收试剂盒的方法进行回收，使用20μL无 菌水洗脱，得到纯化回收的PCR产物。
[0031] 2. 2酶切
[0032]PCR产物使用以下体系进行酶切，酶切时间1.5h。酶切体系为：BamHI2.5μL， XhoI2. 5yL，DNA〈0. 3yg，灭菌的双蒸水加至50yL。酶切后纯化回收得到经过双酶切的PCR产物。
[0033] 质粒ρΕΤ-28α⑴的双酶切：挑取含有该质粒的大肠杆菌DH5α单菌落，过夜培 养。使用质粒提取试剂盒提取质粒，用BamHI和XhoI按以下体系双酶切酶切，酶切时间 lh。酶切体系为：BamHI2yL，XhoI2yL，质粒DNA〈lyg，灭菌的双蒸水加至20yL。酶 切后纯化回收得到经过双酶切的ρΕΤ-28α(+)载体。
[0034] 上述双酶切使用的限制性内切酶为Thermo公司生产的快速内切酶，酶切后的纯 化回收使用核酸纯化回收试剂盒（Magen，HipureGelPureDNAMicroKit)，质粒提取试 剂盒为上海捷瑞生物工程有限公司的质粒小量制备试剂盒，操作方法按其使用说明书。
[0035] 2. 3 连接
[0036] 将经过双酶切的PCR产物和双酶切的ρΕΤ-28α(+)载体按以下体系进行连接：双 酶切PCR产物5μ1，双酶切的ρΕΤ-28α⑴载体〇. 5μ1，Τ4连接酶0. 5μ1 ;连接使用的酶 量为5U/5μL连接体系，连接温度为25 °C，20min。
[0037] 2. 4转化及筛选
[0038] 取10μL连接产物于50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴20~30min，后 于42°C水浴锅热激45s，冰浴2min后加入500μLLB液体培养基，37°C200rpm转速下，孵 育培养30min。取一定量的菌液涂布于含100μL/mL卡那霉素的LB平板，培养20h后挑选 单菌落。单菌落于5mLLB培养基中过夜培养后提取质粒，进行双酶切验证，酶切片段与基 因大小相同的即为阳性克隆。
[0039] 2. 5基因核苷酸序列测定
[0040] 将筛选的正确阳性克隆送至上海美吉生物医药有限公司进行测序，测序结果与脂 肪酶基因lipaseB5核苷酸序列进行比对，确认是将脂肪酶基因lipaseB5(其核苷酸序列如 SEQIDNO. 1所示）插入到ρΕΤ-28α(+)质粒中，结果完全正确后确认得到带有脂肪酶基因 lipaseB5的ρΕΤ-28α(+)质粒（命名为ρΕΤ-28a(+)-lipaseB5)，可用于进行下一步试验。
[0041] 实施例3 :脂肪酶lipaseB5在BL21 (DE3)中的高效表达
[0042] 3. 1BL21(DE3)感受态细胞制备
[0043] 1、将少量大肠杆菌BL21 (DE3)菌种接入5mLLB试管液中，37°C过夜摇培，250rpm;
[0044]