一种脂肪酶LIPDa6及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属生物化工和生物技术领域，具体涉及一种脂肪酶Liroa6及其编码基因 和应用。
【背景技术】
[0002] 手性化合物虽然原子组成是一样的，但它们的立体结构却互为镜像，在生物学和 药学性质上却相差甚远。比如L-薄荷醇具有清凉味，而D-薄荷醇则发霉味；S-天冬酰胺 是甜的，R-天冬酰胺是苦的；R型的"反应停"是孕妇用镇痛药和止痛药，而S型的"反应停" 对胎儿则有致畸作用，历史上曾出现使用反应停导致大规模新生儿畸形的事件。可见合成 手性药物过程中，前体原料的光学纯度是重要环节。
[0003] 手性化合物的合成主要有：（1)化学法，即利用对映体的物理和化学性质的差异 进行分离。通常有盐析法、包结法、以及组合拆分。其缺点是要求对映体之间的性质差异要 大，适用的化合物不多；（2)合成法，通过设计反应来进行手性化合物的化学合成。这种方 法缺点在于反应过程通常比较剧烈，耗费能量，而且反应中使用大量有毒的有机溶剂；(3) 色谱拆分，这种方法是利用填料对手性对映体吸附性质的差异来实现，其缺点是设备昂贵， 普及性较差。
[0004] 脂肪酶（Lipase，EC3. 1. 1. 3)，又叫作三酰甘油水解酶，是一类能够将三酰甘油水 解为甘油和脂肪酸的酶，其来源非常广泛，微生物、植物和动物中都有存在。脂肪酶作为生 物催化剂多数可作用非天然底物，而且可拆分的底物多，立体选择性高，不需要辅助因子， 是一种重要的手性催化剂。
[0005] R-扁桃酸和其衍生物是重要的手性前体，不仅是半合成盘尼西林、头孢菌素、抗肿 瘤药物Goniothalamusstyryllactones和减肥药物Phenethanolamines的合成前体，而且 还是重要的手性拆分试剂。因此R-扁桃酸和其衍生物有十分广泛的市场需求和应用前景。
[0006] 但是，大多数在工业中应用的脂肪酶都是源于进口，比如NovoNordisk公司的 月旨肪酉每Novozym435 (来自Candidaantarctica)，AmanoPharmaceutical公司的Lipase PS(来自Burkholderiacepacia)，Fluka公司的LipaseA(来自Candidaantarctica)等。 这些脂肪酶价格昂贵，生产技术受到制约，因此开发具有自主产权的脂肪酶十分必要。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对现有技术中脂肪酶价格昂贵、生产技术受到制约的不足，提 供一种新的脂肪酶LIH)a6及其编码基因和应用。
[0008]本发明从囊胞菌（Dactylosporangiumaurantiacumsubsp.Hamdenensis)NRRL 18085中开发了一种新的脂肪酶LIH)a6及其编码基因脂肪酶基因lipDa6,构建了含有脂肪 酶基因lipDa6的重组表达载体和基因工程菌，培养基因工程菌后获得脂肪酶LIPDa6,其可 应用于手性拆分（R，S)_扁桃酸甲酯制备（R)-扁桃酸甲酯。
[0009] 本发明的第一个目的是提供一种脂肪酶LIH)a6,其氨基酸序列如SEQIDN0. 2所 不。
[0010] 本发明的第二个目的是提供一种编码所述的脂肪酶Liroa6的脂肪酶基因 lipDa6〇
[0011] 优选，所述的脂肪酶基因lipDa6的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0012] 本发明还提供一种含有所述的脂肪酶基因lipDa6的重组表达载体。所述的表达 载体，优选pET28a(+)载体。
[0013] 本发明还提供一种含有所述的脂肪酶基因lipDa6的基因工程菌。所述的基因工 程菌，优选大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0014] 本发明的第三个目的是提供所述的脂肪酶Liroa6在制备（R)-l-扁桃酸甲酯中的 应用。
[0015] 优选，其步骤为：取脂肪酶Liroa6于pH为5. 0-9. 0的缓冲液中，再加入（R，S)-扁 桃酸甲酯进行反应，得到（R) -1-扁桃酸甲酯。
[0016] 所述的缓冲液，优选为醋酸-醋酸钠、Na2HP04/NaH2P〇dPTris-HCl缓冲液中的一 种。
[0017] 本发明的第四个目的是提供所述的脂肪酶LIH)a6在耐受Ca2+、Li2+、Fe2+、Mg'甲 醇或乙醇环境下进行催化的应用。
[0018]本发明的脂肪酶LIFOae来源于囊胞菌（D.aurantiacumsubsp.Hamdenensis) NRRL18085,保存在中国科学院南海海洋研究所。本发明利用生物信息学分析的方法，从基 因组测序的囊胞菌（D.aurantiacumsubsp.Hamdenensis)NRRL18085中克隆得到脂肪酶基 因lipDa6,全长为795bp(从起始密码子到终止密码子），其编码的脂肪酶LIH)a6,共包含 264个氨基酸；该基因是一个全新的脂肪酶基因。通过克隆脂肪酶基因lipDa6并将其连接 表达载体pET-28a(+)后转化大肠杆菌BL21 (DE3)，培养并诱导表达后，得到了重组表达的 脂肪酶LIH)a6。脂肪酶LIH)a6可催化拆分（R，S)_扁桃酸甲酯，在优化的条件下，制备得 到光学纯度达99%的（R)-l-扁桃酸甲酯。脂肪酶LIH)a6具有稳定性高、催化效率高的优 点，在生物化工和生物医药领域具有非常大应用价值。
[0019]本发明的囊胞菌（Dactylosporangiumaurantiacumsubsp.Hamdenensis)NRRL 18085已在本申请以前公开记载于美国专利，其专利号为US4918174的专利中，该专利的 申请日为1986年9月26日；根据该专利文献的记载，Dactylosporangiumaurantiacum subsp.hamdenensisNRRL18085保藏于美国农业研究菌种保藏中心（Agricultural ResearchServiceCultureCollection，简写：NRRL)，其登录号为NRRL18085。
【附图说明】
[0020] 图1是不同侧链长度的对硝基苯酚酯对脂肪酶LIH)a6酶活的影响。
[0021] 图2是脂肪酶LIH)a6的最适pH及pH稳定性，A为最适pH曲线，B为pH稳定性曲 线。
[0022] 图3是脂肪酶LIH)a6的最适反应温度和温度稳定性，A为最适反应温度曲线，B为 温度稳定性曲线。
[0023] 图4是脂肪酶LIH)a6拆分（R，S)-l_扁桃酸甲酯的GC图，A是脂肪酶LIH)a6水 解（R，S)-扁桃酸甲酯，反应3h后的GC图；B是脂肪酶LIH)a6水解（R，S)-扁桃酸甲酯，反 应5h后的GC图；C是扁桃酸甲酯和等摩尔（R)-扁桃酸甲酯混合后的GC图。
[0024] 图5是脂肪酶LIH)a6的蛋白表达纯化情况，1为IPTG诱导后的含pET_28a(+) 质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)全细胞蛋白；2为蛋白Marker;3为未经IPTG诱导的 含pET-28a(+)-LipDa6的大肠杆菌BL21 (DE3)全细胞蛋白；4为IPTG诱导后的含 pET-28a(+)-LipDa6的大肠杆菌BL21(DE3)全细胞蛋白；5为Ni柱纯化后的重组脂肪酶 LIPDa6〇
【具体实施方式】
[0025] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0026] 实施例1 :LipDa6引物设计及开放阅读框边界确定
[0027]提取囊胞菌（D.aurantiacumsubsp.Hamdenensis)NRRL18085 的基因组DNA，经 16SrRNA验证无误后，交至上海美吉生物科技有限公司测序。利用生物信息学手段对基因 组进行注释，分析其中的脂肪酶基因，确定了其中脂肪酶基因lipDa6的开放阅读框，通过 信号分析工具http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/，分析发现其中没有信号肽。 该脂肪酶基因lipDa6是一个全新的脂肪酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，全长 为795bp(从起始密码子到终止密码子），其编码的脂肪酶LIH)a6的氨基酸序列如SEQID NO. 2所示，共264个氨基酸。
[0028] 根据分析得到的脂肪酶基因lipDa6序列，设计全长扩增引物如下：正向引物：5'_ CACGAATTCGTGACCTTCCATCCCGTGCCAG-3'，下划线为EcoRI酶切位点；反向引物:5'_CCCAAGC HTTAGCGCAGGACGTCGTCGAG-3'，下划线为HindIII酶切位点。
[0029] 实施例2:脂肪酶基因lipDa6的克隆及载体构建
[0030] 2. 1PCR扩增
[0031]将实施例 1 设计的引物（正向引物 5 ' -CACGAATTCGTGACCTTCCATCCCGTGCCAG-3 '， 反向引物5' -CCCAAGCTTTTAGCGCAGGACGTCGTCGAG-3'）送至上海生物工程有限公司合成引 物，合成的引物使用TE稀释到10μM，提取（采用Thermo公司的GeneJetGenomicDNA PurtificationKit进行基因组DNA提取纯化）囊胞菌（D.aurantiacumsubsp.Hamden ensis)NRRL18085的总DNA作为DNA模板，建立如表1所示反应体系：
[0032] 表1PCR反应体系
[0033]
[0034] 使用以下PCR扩增程序扩增脂肪酶基因lipDa6 :a. 95°C变性5min;b. 95°C变性 lmin，60°C退火 0. 5min，72°C延伸lmin20s，进行 30 个循环；c. 72°C延伸lOmin，冷却到 10 Γ〇
[0035] 将PCR产物在1%琼脂糖凝胶中，120V电压下电泳20min，置于凝胶成像系统中观 察。回收800bp左右的条带。PCR产物按照胶回收试剂盒的方法进行回收，使用20μL无菌 水洗脱，得到纯化回收的PCR产物。
[0036] 2. 2 酶切
[0037] PCR产物使用以下体系进行双酶切，酶切时间lh;酶切体系为：EcoRIlyL， HindIII1μL，PCR产物〈0. 3μg，灭菌的双蒸水加至30μL。酶切后纯化回收得到经过双酶 切的PCR产物。
[0038]质粒pET_28a(+)的双酶切：挑取含有该质粒的大肠杆菌DH5α单菌落，过夜培养。 使用质粒提取试剂盒提取质粒，用EcoRI和HindIII按以下体系双酶切酶切，酶切时间lh; 酶切体系为疋〇〇1?11以1^!1;[11(11111以1^质粒0嫩〈1以8，灭菌的双蒸水加至20以匕酶切后 纯化回收得到经过双酶切的pET-28a(+)载体。
[0039] 上述双酶切使用的限制性内切酶为Thermo公司生产的快速内切酶，酶切后的纯 化回收使用核酸纯化回收试剂盒（Magen，HipureGelPureDNAMicroKit)，质粒提取试 剂盒为上海捷瑞生物工程有限公司的质粒小量制备试剂盒，操作方法按其使用说明书。
[0040] 2. 3 连接
[0041] 经过双酶切PCR产物和pET_28a(+)载体按照3 : 1的摩尔比例进行连接。连接 使用的T4连接酶购自北京全式金生物技术公司，连接使用的酶量为5U/5μL连接体系，连 接温度为22°C，连接时间20min。
[0042] 2. 4转化及筛选
[0043] 取5μL连接产物与50μL大肠杆菌DH5a感受态细胞中，冰浴30min，于42°C水浴 锅热激90s，冰浴2min后加入500μLLB液体培养基，37°C200rpm培养lh。培养物4000rpm 离心lmin后，弃上清400μL，余下的100μL涂布于含50μL/mL卡那霉素的LB平板，培养 20h后挑选单菌落。单菌落于5mLLB培养基中过夜培养后提取质粒，进行双酶切验证，酶切 片段与基因大小相同的即为阳性克隆。
[0044] 2. 5基因核苷酸序列测定
[0045] 将