抗凝血因子vii多克隆抗体的杂交瘤细胞株的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及杂交瘤细胞株及其制备方法，具体地，涉及抗人凝血因子VII多克隆 抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 人凝血因子VII是一种由肝细胞合成的依赖维生素K的单链糖蛋白，是机体外源 凝血途径的始动因子。人凝血因子VII在血浆中的浓度仅为（0.5~2)mg/L，半衰期为6~ 8小时，人体中无论是原发性还是继发性的凝血因子VII缺乏，都有可能造成出血，甚至危 及生命。研究已证实，人凝血因子VII不仅在生理止血方面具有重要的作用，而且其血浆水 平的高低基因多态性还与一些疾病的发生存在相关性。人凝血因子VII多克隆抗体除用于 基础研究外，还可用于制备高纯品人凝血因子VII及制备人凝血因子VII检测试剂。此外， 人凝血因子VII凝固活性和抗原含量检测都可以利用人凝血因子VII抗体。国内目前尚未 见研制人血浆凝血因子VII多克隆抗体的报道，也无高纯度人凝血因子VII产品，所用的人 凝血因子VII检测试剂基本购自国外，而要通过制备高纯品人凝血因子VII和人凝血因子 VII检测试剂必须先制备出人凝血因子VII多隆抗体。
[0003] 因而，本领域中存在着对人凝血因子VII多克隆抗体的需求。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述问题，本发明提供了一种分泌抗人凝血因子VII多克隆抗体的杂交 瘤细胞株及其制备方法。
[0005] 在第一个方面，本发明提供了一种制备分泌抗人凝血因子VII多克隆抗体的杂交 瘤细胞株的方法（在本文中有时也简称为"本发明的方法"），所述方法包括以下步骤：
[0006] 1)制备免疫抗原：通过同型双功能蛋白交联剂将人凝血因子VII与牛血清白蛋白 偶联，得到人凝血因子VII-牛血清白蛋白偶联物；
[0007] 2)免疫小鼠：采用小剂量多次免疫方案，利用步骤1)中得到的人凝血因子 VII-牛血清白蛋白偶联物作用免疫抗原，对Balb/c小鼠进行免疫；
[0008] 3)细胞融合：将SP2/0小鼠骨髓瘤细胞与步骤2)获得的免疫Balb/c小鼠的脾脏 细胞融合，在含有HAT的RPMI-1640培养基中进行选择性培养；
[0009] 4)杂交瘤细胞的选择性培养：在步骤3)中融合后的细胞在HAT培养基中选择性 培养后，选择小鼠脾脏细胞与小鼠杂交瘤细胞SP2/0的融合细胞；以及
[0010] 5)鉴定：检测步骤4)中获得的融合的杂交瘤细胞的培养上清，鉴定分泌抗人凝血 因子VII多克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0011] 在第二个方面，本发明提供了分泌抗人凝血因子VII多克隆抗体的杂交瘤细胞株 (下文中有时称为"本发明的杂交瘤细胞株")，所述杂交瘤细胞株是通过本发明的方法制备 的。
[0012] 在一个优选的实施方案中，通过本发明的方法制备的一株杂交瘤细胞株于2015 年11月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏 中心，保藏编号为CCTCCC2015195,培养物名称为：杂交瘤细胞株F7-P-01。
【具体实施方式】
[0013]定义：
[0014] "蛋白交联剂"是一类小分子化合物，其分子两端各有一个或者更多个针对特殊基 团（-nh2、-cooh、-hs等）的反应性末端，可以和生物分子上的活性基团分别偶联，从而使这 些分子结合在一起。蛋白交联剂可分为同型双功能交联剂（也称为"同源交联剂")、异型双 功能交联剂（也称为"异源交联剂"）和光活化交联剂（也称为"光反应性交联剂"）三类。
[0015] 同型双功能蛋白交联剂的分子两端具有相同的反应性末端或活化反应基团。常用 的同型双功能交联剂在本领域中是公知的，其非限制实例包括但不限于，NHS酯类交联剂诸 如N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)、二硫代双（琥珀酰亚胺基丙酸酯）（DSP)和3, 3' -二硫代双 (磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯）（DTSSP)、琥珀酸辛二酸二亚胺（DSS)和丁二烯-苯乙烯共聚 物（BS)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯（DST)和Sulfo-DST、双（2-[琥珀酰亚胺氧羰基氧）乙基） 砜（BS0C0ES)和sulfo-BSOCOES、乙二醇双[琥珀酰亚胺基丁二酸](EGS)和sulfo-EGS、琥 珀酸辛二酸戊二酸盐（DSG)、Ν，Ν'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯（DSC);碳二亚胺类诸如1-乙 基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC);亚氨酯类交联剂诸如二甲基二亚胺酯 (DMA)、二甲基亚胺酯（DMP)、二甲基苯二酸亚胺酯（DMS)、二叔丁基过氧化物（DTBP);巯基 反应类交联剂诸如1，4_二（3'-[2'_二硫基吡啶]丙酸酰氨基）丁烷（DTOPB);二氟苯衍 生物的1，5-二氟-2, 4-二硝基苯（DFDNB)、双（4-氟-3-硝基苯基）亚砜（DFDNPS)等；光 反应性交联剂类交联剂诸如双-[β-(叠氮基水杨酰基氨基）乙基]二硫化物（BASED)等； 醛类交联剂诸如甲醛、戊二醛等；双环氧化物类的1，4-丁二醇缩水甘油醛等；酰肼类交联 剂诸如己二酸二酰肼、碳酰肼等；双重衍生物类交联剂诸如被重氮的〇-联甲苯胺、双重氮 联苯胺等；以及双烷基卤化物等。
[0016] 光反应性交联剂是具有光反应性基团的交联剂。同型双功能交联剂的活化反应基 团也可以是光反应性基团。
[0017] 表1中列出了部分同型双功能蛋白交联剂的类型、反应基团、蛋白结合基团、光活 化性等性质。
[0018] 表 1
[0019]
[0020]
[0021] "抗体"(antibody)指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增 殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
[0022] 本发明提供了一种分泌抗人凝血因子VII多克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备 方法。
[0023] 在一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：
[0024] 1)制备免疫抗原：通过同型双功能蛋白交联剂将人凝血因子VII与牛血清白蛋白 偶联，得到人凝血因子VII-牛血清白蛋白偶联物；
[0025] 2)免疫小鼠：采用小剂量多次免疫方案，利用步骤1)中得到的人凝血因子 VII-牛血清白蛋白偶联物作用免疫抗原，对Balb/c小鼠进行免疫；
[0026] 3)细胞融合：将SP2/0小鼠骨髓瘤细胞与步骤2)获得的免疫Balb/c小鼠的脾脏 细胞融合，在含有HAT的RPMI-1640培养基中进行选择性培养；
[0027] 4)杂交瘤细胞的选择性培养：在步骤3)中融合后的细胞在HAT培养基中选择性 培养后，选择小鼠脾脏细胞与小鼠杂交瘤细胞SP2/0的融合细胞；以及
[0028] 5)鉴定：检测步骤4)中获得的融合的杂交瘤细胞的培养上清，鉴定分泌抗人凝血 因子VII多克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0029] 在本发明的方法中，可以采用本领域中公知的任意同型双功能蛋白交联剂，优选 碳二亚胺类蛋白交联剂，更优选roc。
[0030] 在本发明中，动物免疫采用小剂量多次免疫方案，以小鼠为例，常规以100~ 200μg/只的剂量免疫，免疫3~4次。一个具体的免疫方案实例是：使用免疫抗原对7周 龄的雌性Balb/c小鼠进行免疫，按100yg/只的免疫剂量，与弗氏完全佐剂按体积比1:1 混合，乳化达到油包水状，将乳化的完全抗原，颈背部多点皮下注射免疫小鼠，2周后，以相 同抗原和等体积的弗氏不完全佐剂乳化，100μg/只进行加强免疫，2周后行第三次免疫， 剂量与方法同第二次免疫，在细胞融合前对小鼠进行最后一次冲击免疫，1〇〇μg/只的免疫 剂量腹腔注射。
[0031 ] 在本发明的方法中，细胞融合的方法不受限制，可以采用本领域中公知的方法和 流程。
[0032] 在本发明的方法中，抗体检测的方法不受限制，可以采用本领域中公知的检测方