用于全基因组甲基化重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因检测领域，具体涉及一种适用于中量级别（5~200ng)的起始样 本量的用于全基因组甲基化重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法。
【背景技术】
[0002]DNA甲基化是基因组DNA的一种最常见的表观遗传修饰，大量研究表明DNA甲基化 修饰对于维持正常细胞功能、传递基因组遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生等起着至 关重要的作用。伴随着高通量测序的诞生，对DNA甲基化的研究越来越深入，作为DNA甲基 化检测的金标准，全基因组重亚硫酸氢盐测序（WGBS或BS-Seq，WholeGenomeBisulfate Sequencing)[1]，能够对全基因组DNA甲基化进行分析，并且具备了单碱基水平的检测灵敏 度。然而，BS-Seq技术建库起始量要求yg以上，高起始量是限制BS-seq在临床样本应用 的主要因素。
[0003] 目前，BS-Seq技术主要用于已完成测序的物种，需要1~3yg基因组DNA起始构 建文库。BS-Seq文库构建方法如下，详细流程参考Li等[1]:
[0004] (1)gDNA片段化：1~3μg基因组DNA起始量，采用超声波打断仪片段化gDNA，打 断产物直接用于末端修复；
[0005] (2)末端修复：以dNTPs为单核苷酸来源，采用T4DNA聚合酶、T4多核苷酸激酶和 Klenow片段将打断产物修复成平末端，1. 8倍Ampure磁珠纯化；
[0006] (3)加"A" ：以dATP为单核苷酸来源，采用Klenow(3' -5'exo_)为平末端3'端加 A，1. 8倍Ampure磁珠纯化；
[0007] (4)加甲基化接头：采用T4DNA连接酶将带T的甲基化接头连接在含A的DNA片 段两端，1. 8倍Ampure磁珠纯化；
[0008] (5)重亚硫酸氢盐处理：采用EZDNAMethylation-GoldKit对胶回收产物进行 重亚硫酸氢盐处理反应；
[0009] (6)片段筛选：采用琼脂糖凝胶电泳回收300~350bp范围内的片段，QIA-quick GelExtractionKit进行胶纯化回收；
[0010] (7)PCR扩增：采用ΚΑΡΑHiFiHotstartUracil+ReadyMix对胶回收产物进行PCR 扩增，扩增产物〇. 9倍Ampure磁珠纯化，文库构建完成。
[0011] 2012 年，Miura等 提出了Post-BisulfiteAdaptorTagging(PBAT)全基因 组甲基化建库方法，利用Bisulfite处理过程中的损伤作用片段化DNA，接着以单链的 Bisulfite产物为模板，以含有生物素标记的Oligol为引物合成一链（1轮反应），核酸外 切酶I消化合成不完全的单链DNA，再用链亲和素磁珠M280调取一链产物，以一链产物为模 板和01ig〇2引物合成二链，最后以Illumina公共PE引物和Index引物扩增出文库。2014 年，Swallwood等[3]对PBAT法进行调整后，将基于两条链合成的BS建库方法应用到单细胞 全基因组甲基化检测，并将其命名为scBS测序技术，该方法适于利用小量级别（lng以下） 的单细胞全基因组进行甲基化测序。
[0012] PBAT和scBS两种方法的原理相同，主要通过两个含Illumina接头序列的寡聚 核苷酸引物，在两轮合成反应中添加接头序列，scBS文库构建方法如下，详细流程参考 Swallwood等[3]:
[0013] (l)Bisulfite处理：对gDNA进行Bisulfite处理，利用此过程中的DNA损伤片段 化gDNA;
[0014] (2)-链合成：以单链Bisulfite产物为模板，采用含生物素标记的oligol引物 合成第一条链，一链合成需要5轮反应，此时第一条链的5'端已含有接头序列；
[0015] (3)单链DNA消化：采用核酸外切酶I消化一链合成后呈现单链的DNA序列；
[0016] (4)M280调取：采用链亲和素磁珠M280调取生物素标记的一链产物；
[0017] (5)二链合成：以第一条链为模板，采用01ig〇2引物合成第二条链，此时第二条链 的3'端和5'端均含有Illumina接头序列；
[0018] (6)以第二条链为模板，使用IIlumin通用PCR引物和Index引物扩增得到最终文 库。
[0019] 但是，对于中量级别（5~200ng)的起始样本量，上述两种方法均不能有效适用。
[0020] 参考文献
[0021] 非专利文献
[0022] [1]Li,N. ,etal. ,WholegenomeDNAmethylationanalysisbasedonhigh throughputsequencingtechnology.Methods. 2010. 52(3):p. 203-12.
[0023] [2]Miura.F,Enomoto.Y,Dairiki.R,etal.Amplification-freewhole-genome bisulfatesequencingbypost-bisulfiteadaptortagging.NucleicAcids Research. 2012, 40(17),el36.
[0024] [3]Smallwood.S.A,Lee.H.J,Angermueller.C,etal.Single-cellgenome-wide bisulfitesequencingforassessingepigeneticheterogeneity.Nature Methods. 2014, 11(8):817-20.
【发明内容】
[0025] 本发明人经研究发现，对于中量级别（5~200ng)的起始样本量，如果采用上述 BS-Seq方法构建测序文库，则构建出的文库浓度偏低或者下机数据的冗余度太高；而如果 采用上述PBAT或scBS方法构建测序文库，则存在最终文库有效数据利用率低的情况。需要 说明的是，一般而言，希望最终文库片段主要分布在200~500bp之间，且峰值出现在300bp 左右。
[0026] 鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种适用于中量级别的 用于全基因组甲基化重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法。
[0027] 本发明经过深入研究，在现有的文库构建方法的基础上，对文库构建步骤进行了 巧妙的改进及优化，开发出了适用于中量级别（5~200ng)的起始样本量的用于全基因组 甲基化重亚硫酸氢盐测序的文库构建新方法，从而完成了本发明。
[0028] 即，本发明包括：
[0029] 1.一种用于全基因组甲基化重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法，该方法包括： [0030]步骤A:将5~200ng的基因组DNA用超声波打断仪片段化，得到片段化的基因组 DNA；
[0031] 步骤B:对上述片段化的基因组DNA进行重亚硫酸氢盐处理，得到单链的重亚硫酸 氢盐处理产物；
[0032] 步骤C:以上述单链的重亚硫酸氢盐处理产物为模板，使用含生物素标记的 oligol引物合成第一条链；
[0033] 步骤D:使用核酸外切酶消化第一条链合成后体系中的单链DNA;
[0034] 步骤E:使用链亲和素磁珠调取生物素标记的第一条链；
[0035] 步骤F:以上述生物素标记的第一条链为模板，使用〇lig〇2引物合成第二条链；以 及
[0036] 步骤G:以所述第二条链作为模板进行PCR扩增，从而构建二代测序用DNA文库。
[0037] 2.根据项1所述的文库构建方法，其中，
[0038] 在所述步骤A中对得到的片段化的基因组DNA进行磁珠纯化；和/或
[0039] 在所述步骤D中对消化处理后的体系进行磁珠纯化，得到纯化的生物素标记的第 一条链；和/或
[0040] 在所述步骤G中，对所述PCR扩增的产物进行磁珠纯化。
[0041] 3.根据项1所述的文库构建方法，其中，所述步骤C中使用了10~lOOpmol的 oligol引物。
[0042] 4.根据项1所述的文库构建方法，其中，所述步骤C中使用了40pmol的oligol引 物。
[0043] 5.根据项1所述的文库构建方法，其中，所述步骤C中采用如下反应体系合成所述 第一条链：
[0044] 以50μL体系计
[0045] 所述单链的重亚硫酸氢盆处理产物 31.0μL dNTPs ?ΙΟηιΜ) 4·0μ[ Oligoi (10μΜ) 4.0μΙ. l0xBlue Buffer 5.0μΕ 缺失外切酶活性的Klenow片段 4.0μL, 20L ddH20余量
[0046] 6.根据项1所述的文库构建方法，其中，所述步骤G中采用如下反应体系合成所述 第二条链：
[0047] 以50μL体系计，所述生物素标记的第一条链溶于
[0048] dNTPs (lOrnM) 4.0'uL 01igo2 (ΙΟμΜ) 4"0μΙ. lOxBlueBuffer 5.0pL 缺失外切酶活性的Klenow片段 4.0μΙ_.，20U ddH?0 余量
[0049] 7.根据项1所述的文库构建方法，其中，所述步骤A中用超声波打断仪片段化的条 件为：超声打断30秒，停30秒，重复22次。
[0050] 8.根据项1所述的文库构建方法，其中，所述步骤A中将40~150ng的基因组DNA 用超声波打断仪片段化。
[0051] 9.根据项1所述的文库构建方法，其中，所述步骤A中将50~100ng的基因组DNA 用超声波打断仪片段化。
[0052] 10.根据项1所述的文库构建方法，其中，所述步骤A的所述基因组DNA为人类基 因组DNA。
[0053] 发明效果
[0054] 根据本发明，提供一种适用于中量级别（5~200ng)的起始样本量的用于全基因 组甲基化重亚硫酸氢盐测序的文库构建新方法。
【附图说明】
[0055] 图1为文库BSCS140100-1-79的质检结果。
[0056] 发明的【具体实施方式】
[0057] 首先，在一个方面中，本发明提供一种用于全基因组甲基化重亚硫酸氢盐测序的 文库构建方法（本发明的方法），该方法包括：
[0058] 步骤A :将5~200ng的基因组DNA用超声波打断仪片段化，得到片段化的基因组 DNA；
[0059] 步骤B:对上述片段化的基因组DNA进行重亚硫酸氢盐处理，得到单链的重亚硫酸 氢盐处理产物；
[0060] 步骤C:以上述单链的重亚硫酸氢盐处理产物为模板，使用含生物素标记的 oligol引物合成第一条链；
[0061] 步骤D:使用核酸外切酶消化第一条链合成后体系中的单链DNA;
[0062] 步骤E:使用链亲和素磁珠调取生物素标记的第一条链；
[0063] 步骤F:以上述生物素标记的第一条链为模板，使用〇lig〇2引物合成第二条链；以 及
[0064] 步骤G:以所述第二条链作为模板进行PCR扩增，从而构建二代测序用DNA文库。
[0065] 这里，所述基因组DNA是基因组中存在甲基化修饰的物种的基因组DNA，例如哺乳 动物基因组DNA或人基因组DNA。作为起始的基因组DNA的量优选为40~150ng，更优选 为50~100ng。对于获得该基因组DNA的方式没有限制，例如可以从样本中提取，所述样本 例如为血液。但需要说明的是，本发明的方法并不包含任何的介入性步骤，例如采血步骤。
[0066] 在将所述基因组DNA片段化时，超声波打断仪的操作条件可以为：超声打断30秒， 停30秒，重复22次。
[0067] 所述