一种用于葫芦科作物的针刺接种病毒方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种病毒接种方法在病毒生物学工作、抗病品种筛选或选育及以病毒 为载体的生物活性物质的生产中的应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 在农业生产中，各种粮食蔬菜作物几乎都会发生病毒病，蔬菜作物中以茄科、萌芦 科、豆科、十字花科等受害较为严重，感染的病毒种类也很多。其中萌芦科作物的病毒病在 世界各种植地区几乎均有发生。其中以南瓜发病最为严重，甜瓜次之，黄瓜、西瓜、瓠子等作 物也都有不同程度感染。目前已经报道的危害萌芦科作物的病毒多达48种，发生普遍且危 害较为严重的主要有：黄瓜花叶病毒（CMV)、小西萌芦黄花叶病毒（ZYMV)、黄瓜绿斑驳花叶 病毒（CGMMV)、西瓜花叶病毒（WMV)、南瓜花叶病毒（SqMV)、烟草花叶病毒（TMV)等。
[0003]接种试验是植物病害及其衍生工作的基础，是研究植物对病原的侵染过程和流行 规律、病害的防治、品种抗性筛选和抗病品种选育及其利用病原为载体进行生物活性物质 生产等各个方面的工作的前提。除必须利用昆虫或低等真菌等为媒介的部分病毒外，多数 病毒现有接种方法为摩擦接种，其步骤是先将感染病毒的植株叶片在pH7. 0的磷酸缓冲 液中充分研磨，再在待接种植株较幼嫩的真叶上均匀撒上少量石英砂，然后用手指或小刷 子等蘸取研磨的病汁液在叶片上来回轻轻摩擦，最后用清水将叶面多余的病毒接种液和石 英砂轻轻洗去。该方法的缺点是费时费力，对每个接种植株均要来回喷洒、摩擦和清洗；具 有一定技术难度，对植物伤害大，摩擦过重可能会导致细胞甚至植株受损过大而死亡；植株 间接种量误差大，每次接种所蘸取的病汁液的量无法固定；整个周期较长，从播种到观察结 果约为60-80天左右。农杆菌侵染性克隆接种植物时一般采用浸润法，即用无针头的注射 器吸取准备好的菌液在4-6片真叶展开的植株叶片背面将注射器按压在上面，缓慢将菌液 渗透注射到组织间隙中。该方法适用于烟草等叶片较薄、细胞组织间较疏松的植物；而大多 数萌芦科作物叶片较厚细胞组织致密，菌液较难渗透注射到组织间。
[0004] 鉴于目前接种方法的各种不足之处，设计一种省时、高效的接种方法具有重要意 义，本发明提早了接种时期，不需要移栽定植，且接种方法更加简便，大大缩短了接种鉴定 工作的周期，尤其适用于大批量植株的接种工作，在抗性筛选、抗病品种选育、病毒生物学 工作及以病毒为载体进行生物活性物质的生产等方面具有重要作用。
【发明内容】
[0005]针对目前传统摩擦接种方法的不足，本发明旨在提供一种省时省力、高效接种病 毒及其病毒衍生物的方法。
[0006]本发明所述具体步骤为：1)在穴盘中育苗，除工作目标要求接种苗长至成株或挂 果等需移栽定植外，一般后续工作均在穴盘中完成；2)待幼苗生长至第一片真叶展开之前 进行接毒处理；3)将含目标接种物的叶片在磷酸盐缓冲液中充分研磨，或生长至指数期的 农杆菌介导的病毒侵染性克隆的菌液，用准备好的消毒针蘸取一下汁液或菌液，刺入幼苗 胚轴部位1至10下。4)将幼苗置于合适的温度和光照条件下，约10-14天后即可观察及检 测发病情况，一般不超过40天。
[0007] 所述针刺接种病毒方法，其特征在于步骤1)中使用540mmX280mm，标准穴盘，孔 穴为18-32穴，此种规格的穴盘孔穴能够满足幼苗生长至整个观察周期结束，从而保证从 育苗到接种到观察整个工作均在穴盘中完成，如此可省去移栽定植的步骤，有效缩短接种 工作周期且节省工作所需要空间，适用于高通量接种工作。较大规模的接种工作在普通温 室中也可完成，实现一年四季均可开展相应工作，减少了生物学工作对气候因素的依赖。
[0008] 所述针刺接种病毒方法，其特征在于步骤2)中针刺接毒所用苗龄为从幼苗出土 到第一片真叶展开之前，因针刺胚轴对幼苗造成的伤害小几乎不影响植株的正常生长，因 此无需考虑苗龄因素。在萌芦科作物幼苗真叶展开之前即进行接种，较之常规接种时期更 早，且后续的病毒潜育期也较常规情况下短，从育苗到调查整个周期约为30-45天，较之传 统摩擦接种的周期（60-80天）大大缩短。
[0009] 所述针刺接种病毒方法，其特征在于步骤3)中针刺接种所用针具范围较广、方便 易得，包括昆虫解剖针、针灸针、绣花针、钩针、牙签等均可以使用。可视针尖的粗细和苗的 大小，在蘸取接种物后刺入深度为胚轴直径的1/10至4/5、刺接次数1-10下，以保证成功接 种的同时植物受到的伤害最小为宜。每刺一株植株蘸取一下病汁液或者菌液，保证了接种 量的相对一致性。
[0010] 此方法可适用于所有萌芦科作物的接种，并可用于所有可通过摩擦接种的病毒和 人工构建的侵染性克隆及人工构建的含目标基因的病毒载体。这一方法尤其在进行大批量 工作时，实验周期更短，操作更简便，很大程度上减轻了工作量，可应用于大规模生物学工 作，如品种抗性筛选、抗病品种选育、以病毒为载体的生物学活性物质生产等。
【附图说明】
[0011] 图1为萌芦幼苗接种方法示意图。（a)子叶；(b)第一片未展开的真叶；（c)胚轴； (d)接种针
[0012] 具体实施方法
[0013] 下面通过具体实施例来进一步说明本发明。以下实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0014] 实施例1
[0015] 几种不同的接种方法发病率比较
[0016] 1. 1试验材料与方法
[0017] 将萌芦种子播种于32孔穴盘里，置于温室，待其自然萌发并生长至2片真叶展开 时期。采1-2片感染CGMMV的病叶，在研钵中加入少许石英砂和适量磷酸缓冲液，充分研磨， 制备病汁液备用。将构建好的侵染性克隆活化，并于28°C200rpm生长至0D600约0.6后离 心收集菌体并用1/2MS重悬，加入终浓度为100ymol/L的乙酰丁香酮备用。
[0018] 摩擦接种：先向植株叶面撒少许石英砂，用手指蘸取病汁液轻轻来回涂抹。
[0019] 浸润法：用注射器针头在叶片背面轻刺几下，然后去掉针头从所刺部位用注射器 将菌液渗透注射到组织间隙中。
[0020] 注射法：用带针头的注射器从叶片背面刺入主叶脉，轻轻推入适量病汁液或者菌 液
[0021] 针刺法：用昆虫解剖针蘸取病汁液或者菌液，轻刺植株胚轴部位N下（N指1-10 下），以不刺穿为宜。
[0022] 将接种后的植株置于27°C培养箱，光照培养两周后开始观察发病情况至汁液摩擦 接种处理充分表现症状为止，出现斑驳花叶症状的视为发病。
[0023] 1. 2试验结果
[0024] 摩擦接种为病毒接种寄主植物的传统方法，浸润法为侵染性克隆接种植物最常用 的方法，而针刺法和注射法均可用于病汁液和侵染性克隆的接种，将它们接种后的发病率 进行比较，结果发现摩擦法、注射法和针刺法接种CGMMV病汁液的植株发病率均为100% ; 浸润法、注射法和针刺法接种侵染性克隆的植株发病率分别为75. 0%、100%和100%。
[0025] 实施例2
[0026] 针刺接种法进行黄瓜对CGMMV的抗性鉴定
[0027] 1. 1试验材料与方法
[0028] 将15种不同品种的黄瓜种子（表1)播种于32孔穴盘，置于温室，待其自然萌发 并生长至第一片真叶展开时期，用于接种病毒。采1-2片感染CGMMV的病叶，在研钵中加入 少许石英砂和适量磷酸缓冲液，充分研磨，制备病汁液。用针灸针蘸取病汁液在植株胚轴部 位刺N下（N指1-10下），每接种一棵植株蘸取一次病汁液。接种后的植株置于温室正常管 理，生长20天后，对每棵植株采叶片用ELISA检测其病毒感染情况。
[0029] 1. 2试验结果
[0030] 通过接种后检测，结果发现不同的黄瓜品种均可感染CGMMV，接种后的抗性程度不 同，其中"中农28号"和"新四号"发病率最高，达到100% ;而"新津春四号"发病率最低， 仅为48%。
[0031] 表1不同黄瓜品种接种CGMMV
[0032]
[0033]
[0034] 实施例3
[0035] 针刺接种法进行砧木南瓜对CGMMV的抗性鉴定
[0036] 1. 1试验材料与方法
[0037] 将15种不同品种的砧木南瓜种子（表2)播种于32孔穴盘，置于温室，待其自然 萌发并生长至第一片真叶展开时期，用于接种病毒。采1-2片感染CGMMV的病叶，在研钵中 加入少许石英砂和适量磷酸缓冲液，充分研磨，制备病汁液。用钩针蘸取病汁液在植株胚轴 部位刺N下（N指1-10下），每接种一棵植株蘸取一次病汁液。接种后的植株置于温室正常 管理，生长20天后，对每棵植株采叶片用ELISA检测其病毒感染情况。用同样苗龄经摩擦 接种的植株作为对照组。
[0038] 1. 2试验结果
[0039] 通过接种后检测，结果发现不同的砧木南瓜品种均可感染CGMMV，接种后的抗性程 度不同，其中"赛青松"发病率最高，达到65% ;而"依蓝柯"发病率最低，仅为10%。摩擦 接种的对照植株发病率为42. 4%。
[0040] 表2不同砧木南瓜品种针刺接种CGMMV的发病率
[0041]
[0042]
[0043] 上述实施不以任何形式限定本发明。
【主权项】
1. 一种萌芦科作物接种病毒的方法，其特征在于：在穴盘培育的条件下的接种方法， 待萌芦科作物幼苗生长到特定阶段，用针状物蘸取不同途径获得和不同种类的毒源，轻刺 胚轴部位N下，以达到植株感染病毒的目的。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：从育苗到接种以及观察整个过程均在穴 盘中完成，穴盘规格为540mmX280mm，18-32孔穴。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所用工具为昆虫针、针灸针、钩针、绣花针 等所有针状物及其具有类似针刺功能的尖锐物体。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：接种特定阶段为出苗至第一片真叶展开 之前。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：接种部位为幼苗的胚轴，接种时针与胚轴 间以0. 1-179. 9度角刺入胚轴，以不穿透为宜。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：该方法适用毒源为所有可用病汁液摩擦 接种感染萌芦科作物的病毒及其人工构建的相应病毒的侵染性克隆。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：该方法适用作物对象为萌芦、黄瓜、西瓜、 南瓜、瓠瓜、甜瓜等所有萌芦科作物。
【专利摘要】本发明提供了一种简便、高效的葫芦科作物病毒及其病毒衍生物的接种方法，属生物技术领域。该方法适用于所有可通过摩擦接种葫芦科作物的病毒、相应病毒的侵染性克隆和改造过的病毒载体，整个操作仅在穴盘中完成，通过针刺接种，实现病毒有效感染植株的目的。与传统的摩擦接种法相比，该方法具有操作简便、效率高、适用范围广、接种量相对固定、操作周期短等一系列特点，是一种快速简便高效的植物病毒接种方法，可用于大规模的病毒生物学工作、品种抗性筛选与利用、抗病品种选育和以病毒为载体的目标生物活性物质的生产。
【IPC分类】C12N15/82
【公开号】CN105349572
【申请号】CN201510893995
【发明人】杨柳, 程兆榜, 任春梅, 陆芳, 缪倩
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月4日