一种具有抗菌活性的水蛭多肽锌螯合物的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及水生动物生物制品生产技术领域，特别是涉及一种具有抗菌活性的水蛭多肽锌螯合物的制备方法。
【背景技术】
[0002]近年来随着医药技术的发展，抗生素已经成为人们经常使用的药品之一。随着抗生素越来越广泛的应用，出现了滥用抗生素等一系列问题，这些问题严重威胁人类的生命健康。目前在全世界医疗领域，不合理使用和滥用抗生素的情况非常严重，直接导致一些细菌产生了较强的耐药性，从来降低抗生素的效率。
[0003]面对一些细菌耐药性日益严重的情况，最有效和最直接的办法就是找到一种具有很强抑菌能力的新型抗生素。研究表明，一些小肽可以与一些金属离子在一定条件下发生螯合反应生成一种多肽螯合物。这种多肽螯合物不仅具有广谱和高效的抗菌活性，还有很强的热稳定和酸碱稳定性、无毒害作用等特点。所以多肽金属螯合物被认为是一种具有很大应用潜力的新型抗生素。
[0004]目前对多肽螯合物的制备工艺和生物活性的研究较多，这些研究合成多肽螯金属合物所用的多肽原料大多是通过一般酶解法获得，蛋白水解率和多肽得率都较低，获得的多肽中有很多酶解不完全的大分子肽类，这些大分子肽类与小分子肽类相比拥有较少的金属螯合点，所以这类大分子肽类在与金属离子进行螯合反应时能大大降低反应的螯合率以及产物得率，造成多肽原料的浪费，增大经济成本。所以对酶解后的多肽用凝胶层析柱按分子量大小进行分离，将分离出的较小分子量的多肽再与金属离子进行螯合反应，对提高螯合反应的螯合率以及多肽金属螯合物的得率有很大的意义。另外，酶解和螯合反应条件对多肽锌的得率等也有很大影响，所以对多肽锌制备工艺进行优化，对提高螯合反应的螯合率以及多肽金属螯合物的得率也具有积极意义。
[0005]宽体金线蛭俗称蚂蝗，广泛分布于我国各地区的湖泊、池塘以及水田中。研究表明宽体金线蛭含有丰富的蛋白质，粗蛋白的含量达其干重的78.11%，与大多数鱼类相当。一些制药企业在提炼宽体金线蛭中的药用成分后，将剩余宽体金线蛭组织作为药渣丢弃处理，不仅污染环境还造成了大量蛋白质的浪费。本实验以宽体金线蛭作为蛋白源制备多肽锌螯合物，可使废物再利用，为相关企业产生良好的社会效益和经济效益。
【发明内容】
[0006]发明目的:本发明的所要解决的技术问题是提供了一种具有抗菌活性的水蛭多肽锌螯合物的制备方法。
[0007]技术方案:为了解决上述技术问题，本发明提供了一种具有抗菌活性的水蛭多肽锌螯合物的制备方法，包括以下步骤:
1)宽体金线蛭组织脱脂:将宽体金线蛭冻死后匀浆，匀浆液中加入脱脂剂，在常温下脱脂12~24h，脱脂液离心，将沉淀冷冻干燥得到脱脂产物； 2)宽体金线蛭源蛋白的酶解:将脱脂产物与去离子水按1:10~1:20(w/v)混合，加入复合酶或单一酶进行催化水解反应，反应液离心后保留上清液，冷冻干燥，制得宽体金线蛭多肽冻干粉粗品；
3)宽体金线蛭多肽分离纯化:将宽体金线蛭多肽冻干粉溶于去离子水，配制多肽浓度为10mg/ml的样品溶液，将5ml样品上凝胶层析柱分离，用去离子水洗脱，通过层析柱蛋白质分子量标准曲线测算各组分分子量，将分子量小于10KD的组分合并后冷冻干燥，经过多次分尚，获得足量分子量小于10KD的多肽冻干粉；
4)宽体金线蛭酶解多肽与七水合硫酸锌的螯合反应:将分离后的分子量小于10KD的多肽冻干粉溶于去离子水中得到多肽溶液，加入七水合硫酸锌，在恒温磁力搅拌水浴中进行螯合反应；
5)螯合反应产物的醇沉分离和洗涤:将步骤4)所得的各组螯合反应液用体积分数为70%~90%乙醇溶液反复洗涤、离心数次保留沉淀，在离心上清液中加入5~8滴0.2%双硫腙-氯仿试液，待上清液无颜色反应后，将所得沉淀物冷冻干燥，制得宽体金线蛭多肽锌螯合物。
[0008]上述方法中，步骤1)所述的脱脂剂为含有0.5%柠檬酸的异丙醇或含有0.5%柠檬酸的乙酸乙酯，所述脱脂剂量为0.5-1.0倍样品重量。适当脱脂剂和加入量可以快速对宽体金线蛭组织进行脱脂，避免脱脂剂过量产生浪费。
[0009]上述方法中，步骤2)中每毫克脱脂物加入100U~150U酶活力的复合酶或单一酶进行催化水解反应。复合酶对比单一酶解法制得的多肽水解度更高，在一定范围水解度内，多肽与金属离子的螯合率随着多肽的水解度增加而升高，高的水解度有利于多肽与金属离子的螯合反应。
[0010]上述方法中，所述步骤2)中酶解反应的温度为40°C ~50°C，pH为6.0-8.0，反应时间为6~10h。适宜的反应温度、pH和时间，可使酶的活性最强，加快水解蛋白的速度。
[0011]上述方法中，所述步骤3)中的凝胶层析柱为Sephacryl S-100层析柱，分离收集分子量小于10KD的小肽。S印hacryl S-100层析柱可以对1KD到100KD分子量的蛋白质和多肽进行分离纯化，经过对酶解液的纯化能够得到小分子多肽，小分子量的多肽有利于提高与锌离子的螯合率。
[0012]上述方法中，所述步骤4)中加入锌离子与多肽的质量比为多肽溶液的浓度为10mg/ml~20mg/ml。适当的多肽浓度与适当比例的锌盐进行螯合反应有助于提高反应螯合率。
[0013]上述方法中，所述步骤4)恒温磁力搅拌水浴中进行反应的条件为温度35°C ~45°C，pH为6.0-7.0，时间为50~90min。在适宜的温度、pH、时间条件下，螯合反应可以获得高的螯合率和螯合产物产率。
[0014]通过牛津杯法抑菌试验发现本发明所制得的一种种宽体金线蛭多肽锌螯合锌对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌都有较强的抑菌效果，而其螯合原料多肽对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌没有明显的抗菌活性。
[0015]与现有技术相比，本发明的优点为:
(1)在宽体金线蛭组织匀浆脱脂过程中，脱脂剂种类的选择、加入脱脂剂的比例的工艺优化大大增加了宽体金线蛭组织匀浆脱脂的速度和效果，脱脂后的宽体金线蛭组织的色素含量少、腥味很轻。
[0016](2)用木瓜蛋白酶和风味蛋白酶组成的复合酶，能够得到水解度很高的多肽，在优化的工艺条件下能够很大程度提高多肽和金属离子的螯合率。
[0017](3)用Sephacryl S-100层析柱对宽体金线輕多肽进行分离纯化，能够得到分子量小于10KD的多肽组分。这种多肽组分与锌离子离子进行螯合反应的螯合率最高达84.16%，制备所得的多肽锌螯合物经过生物活性检测还具有明显抗菌活性的。通过检测，50mg/ml的宽体金线蛭多肽锌螯合物对浓度为105cfu/mL的大肠杆菌的抑菌圈直径达22mm，对浓度为105cfu/mL的枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径达13mm。
[0018](4)对螯合反应和螯合反应液醇沉和洗涤工艺的优化，获得了较高多肽螯合物得率，本发明制备的宽体金线蛭多肽锌螯合物的得率最高达41.22%。
【附图说明】
[0019]本发明通过牛津杯法对制备的宽体金线蛭多肽锌螯合物对不同种类的浓度为105cfu/mL的细菌进行了抑菌试验，发现了其对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌具有明显抑菌效果，而其相同浓度的多肽对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌没有明显抑菌效果。
[0020]图1为浓度为50mg/ml的宽体金线蛭多肽(分子量小于10KD)和浓度为50mg/ml的这种多肽的锌螯合物对大肠杆菌的抑菌效果图。其中阳性对照为lmg/ml的诺氟沙星溶液，阴性对照为无菌水；
图2为浓度为50mg/ml的宽体金线蛭多肽(分子量小于10KD)和浓度为50mg/ml的这种多肽的锌螯合物对枯草芽孢杆菌的抑菌效果图。其中阳性对照为lmg/ml的诺氟沙星溶液，阴性对照为无菌水。
[0021]图3 Sephacryl S-100层析柱蛋白质分子量标准曲线；
本实验通过四种已知分子量的标准品物质，测定试验条件下的Sephacryl S-100层析柱分子量标准曲线。分别称取20mg左右的牛血清蛋白(67000Da)、β-乳球蛋白