一种检测K-ras基因突变的试剂盒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因突变的检测，具体涉及一种检测K-ras基因突变的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 结直肠癌是严重危害人类生命健康的临床最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在 全球约排在第三位，在中国约排在第四位，寻找有效的结直肠癌治疗手段一直是肿瘤学界 研究的方向。近年来出现的新的治疗方法-靶向治疗，使个体化治疗成为可能，明显提高 了肿瘤治疗的疗效。在结直肠癌得靶向治疗中，两种抗EGFR的单抗类药物西妥昔单抗 (Cetuximab，商品名Erbitux)和帕尼单抗（Panitumumab，商品名Vectibix)能特异性的抑 制具有野生型K-ras基因的结直肠癌组织细胞的生长，使病人的预后得到改善。因此，结直 肠癌组织细胞中K-ras基因的突变状态是决定西妥昔单抗和帕尼单抗是否有效的关键指 标。目前已知在结直肠癌治疗过程中，抗EGFR单抗治疗K-ras野生型患者的获益显著优于 突变性患者，K-ras基因突变状态是抗EGFR单抗类药物疗效的独立预测指标。K-ras基因 突变状态与抗EGFR单抗类靶向药物治疗结直肠癌病人的疗效密切相关，只对K-ras基因野 生型患者推荐接受EGFR抑制剂治疗。
[0003] K-ras基因突变检测是目前临床医生了解大肠癌患者癌基因状况最直接、最有效 的方法，不仅可以深入了解癌基因的情况，更重要的是筛选出针对抗EGFR靶向药物治疗有 效的结直肠癌患者，帮助临床医生选择制定对肿瘤患者最有效的治疗方法。目前在欧美等 发达国家，K-ras基因检测已经成为结直肠癌患者内科治疗前的常规检查。在通常情况下， 60%左右结直肠癌患者的K-ras基因都是野生型的，如果都接受了K-ras基因突变检测，通 过个体化的综合治疗方案，在化疗基础上加靶向药物，有效率可达60%左右。所以，越早做 K-ras基因检查，患者获益最大。
[0004]目前常用的K-ras点突变检测的方法有DNA直接测序法、单链构象多态性分析 法（PCR-SSCP)、限制性片段长度多态性分析法（PCR-PFLP)、高分辨溶解曲线（HRM)、基因芯 片、液相芯片法、荧光定量PCR法等。测序法是公认的基因突变检测的金标准，能够准确地 显示可能存在的具体突变类型，但测序法所用的设备成本高、检测时间稍长、操作繁琐、灵 敏度较低，而且结果判读较复杂，对操作者要求较高，难以形成商业化的诊断产品。单链构 象多态性分析与限制性片段长度多态性分析步骤繁多、灵敏度低，而且检测结果经常需要 测序法确认，也不是适用于临床检测的简便有效的方法。高分辨溶解曲线是近年来兴起的 一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单 碱基的突变。但是该方法难于筛查纯合突变，并且假阳性假阴性较高，PCR条件苛刻，不能 分型，而且检测结果需要测序法确认。基因芯片和液相芯片虽能准确区分具体的突变类型， 但是其对设备要求高，难以大规模推广，多用于科研单位。荧光定量PCR法具有假阳性较高 等缺点，难于大规模应用于临床诊断。
[0005] 出于这种考虑，本发明的发明人进行了研究，目的是解决相关领域现有技术所暴 露出来的问题，期望提供一种耗时短、易操作、高通量、成本低的检测K-ras基因突变的试 剂盒及其应用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种检测K-ras基因突变的试剂盒，其具有低成本、易操作、 耗时短、灵敏度高和特异性好等突出技术效果，可广泛应用于临床诊断。
[0007] 本发明的目的是通过如下技术方案来实现的：
[0008] 本发明提供一种检测K-ras基因突变的试剂盒，其包括PCR反应试剂、负载有金属 膜的固相支持物以及含有碱性磷酸酶标记链霉亲和素的杂交液；其中，所述PCR反应试剂 包括用于扩增靶核酸的生物素标记的引物，所述固相支持物的表面固定有用于检测K-ras 基因突变的核酸探针。
[0009] 本发明的试剂盒将碱性磷酸酶标记链霉亲和素直接加入到杂交液中，可以在核酸 探针与靶核酸杂交的过程中同步实现碱性磷酸酶标记链霉亲和素与生物素的结合过程，从 而可以在金属膜表面直接形成碱性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联物，不仅省去了传统杂交 反应后需要单独进行酶联反应的步骤，缩短了传统反向斑点杂交的操作耗时，而且促进了 核酸杂交，提高了碱性磷酸酶标记效率，使得金属膜表面单位面积上覆盖的碱性磷酸酶标 记核酸杂交体的偶联物的数量大大增加，再通过显色反应，根据着色的深浅以及杂交信号 与金属膜的强烈色差，可以用肉眼快速判断核酸杂交的结果，在同等条件下明显提高了传 统核酸反向斑点杂交方法的检测灵敏度与分辨能力。
[0010] 在本发明的试剂盒中，所述碱性磷酸酶是一种同源二聚体蛋白，是一种含锌的金 属酶。每分子酶至少含2个Zn原子。酶上包含3种类型的金属结合位点，即所谓的催化结 合位点、结构结合位点和调节结合位点。其中两个催化结合位点的结合则只会导致一个亚 单位的磷酸化，即负协作亚单位之间发生相互作用。
[0011] 在本发明的试剂盒中，所述生物素有两个环状结构I和II。其中，I环为咪唑酮 环，是其与链霉亲和素结合的主要部位；II环为噻吩环，c2上有一戊酸侧链；生物素分子通 过其末端的羧基与本发明所述的靶核酸连接，从而标记在靶核酸分子上。
[0012] 在本发明的试剂盒中，所述链霉亲和素是由链霉菌分泌的一种蛋白质，其分子由4 条相同的肽链组成，每条肽链都能结合一个生物素，因此每个链霉亲和素分子能结合4个 生物素分子。此外，每条肽链的氨基酸组成中，甘氨酸和丙氨酸的含量较大，肽链中的色氨 酸残基是连接生物素的活性基团。所述链霉亲和素与生物素二者亲和结合的常数（K)为 1015L/mol。在本发明的试剂盒中，靶核酸与核酸探针杂交的同时，链霉亲和素与生物素也 进行亲和结合，因此杂交液中的碱性磷酸酶标记链霉亲和素分子与固定在固相支持物表面 的核酸探针分子在一步反应中竞争性结合生物素标记的靶核酸分子。
[0013] 根据本发明的一个具体实施例，所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的 浓度为〇· 05~2μg/ml，优选0· 1~1. 5μg/ml，更优选0· 5~1. 2μg/ml。在本发明的 试剂盒中，可以列举的所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度包括但不限于： 0· 05μg/ml、0. 06μg/ml、0. 07μg/ml、0. 08μg/ml、0. 09μg/ml、0. 1μg/ml、0.2μg/ml、 0· 3μg/ml、0. 4μg/ml、0. 5μg/ml、0. 6μg/ml、0. 7μg/ml、0. 8μg/ml、0.9μg/ml、1μg/ ml、l. 1μg/ml、l. 2μg/ml、l. 5μg/ml和 2μg/ml〇
[0014] 本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，本发明的试剂盒将所述碱性磷 酸酶标记链霉亲和素直接加入到杂交液中，一方面能够使得碱性磷酸酶标记链霉亲和素与 生物素标记靶核酸充分的结合；另一方面还能够促进核酸杂交效率，缩短核酸杂交反应的 时间。
[0015] 在本发明的试剂盒中，所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度是本发 明的重要方面。本发明的发明人经过大量试验与创造性劳动发现，如果碱性磷酸酶标记链 霉亲和素在杂交液中的浓度过低，那么影响靶核酸检测的灵敏度；如果碱性磷酸酶标记链 霉亲和素在杂交液中的浓度过高，那么容易带来非特异性吸附现象，影响靶核酸检测结果 的准确性。
[0016] 根据本发明的一个具体实施例，所述杂交液还包括锌离子、镁离子、表面活性剂和 阳离子型聚合物；其中，所述表面活性剂选自吐温和曲拉通，所述阳离子型聚合物选自阳离 子聚丙烯酰胺、多聚赖氨酸和聚合氯化铝。
[0017] 根据本发明的一个具体实施例，在所述杂交液中，锌离子为0. 001~0.lmol/L，镁 离子为0. 001~0.lmol/L，表面活性剂占杂交液的0. 01~2% (v/v)，阳离子型聚合物占 杂交液的〇. 01~〇. 5 % (w/v);优选地，锌离子为0. 005~0. 05mol/L，镁离子为0. 005~ 0. 05mol/L，表面活性剂占杂交液的0. 05~1 % (v/v)，阳离子型聚合物占杂交液的0. 05~ 0. 2% (w/v) 〇
[0018] 根据本发明的一个具体实施例，所述锌离子可以选自含锌离子的可溶性盐。可用 作本发明的所述含锌离子的可溶性盐的实例包括：硫酸锌、氯化锌以及其他各种在溶液状 态可以解离出锌离子的盐。
[0019] 根据本发明的一个具体实施例，所述镁离子可以选自含镁离子的可溶性盐。可用 作本发明的所述含镁离子的可溶性盐的实例包括：硫酸镁、乙酸镁、氯化镁以及其他各种在 溶液状态可以解离出镁离子的盐。
[0020] 根据本发明的一个具体实施例，所述吐温选自吐温20 (TWEEN-20)、吐温 21(TWEEN-21)、吐温 40(TWEEN-40)、吐温 60(TWEEN-60)、吐温 61(TWEEN-61)、吐温 80 (TWEEN-80)、吐温81 (TWEEN-81)和吐温85 (TWEEN-85)，其中吐温20是特别优选的。
[0021] 根据本发明的一个具体实施例，所述曲拉通选自曲拉通X-100(TritonX-100)、曲 拉通X-114(TritonX-114)和曲拉通X-200(TritonX-200)，其中，曲拉通X-100是特别优 选的。
[0022] 在本发明的试剂盒中，酸、碱、盐离子、温度条件的变化都会改变甚至使碱性磷酸 酶完全失去活性，因此为了实现本发明的目的之一，杂交液成分的选择是极为重要的方面。 本发明的试剂盒通过在杂交液中添加锌离子、镁离子、表面活性剂以及阳离子型聚合物，一 方面有助于提高核酸杂交效率，另一方面防止杂交液中的碱性磷酸酶标记链霉亲和素因吸 附而变性，再一方面防止碱性磷酸酶标记链霉亲和素分子之间因相互作用而导致的聚合变 性。
[0023] 在本发明的试剂盒中，所述阳离子型聚合物能够与生物素标记