抗除草剂基因OsmALS的HRM检测方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种水稻抗咪唑啉酮类除草剂基因 OsmALS基因特异性分子标记的开发和应用。
【背景技术】
[0002] 氨基酸是植物体内必不可少的物质，他除了在植物的蛋白质合成中起作用外，在 初级和次生代谢中也发挥着重要的功能。若植物的氨基酸合成受阻，将导致植物代谢紊 舌L从而使植物生长严重受损甚至死亡，所以植物的氨基酸合成中的关键酶一直是除草 剂研发的热点。乙酰乳酸合成酶（acetolactatesynthase,ALS),也称乙酰轻酸合成酶 (acetohydroxyacidsynthase,AHAS),是支链氨基酸合成中的一个关键酶。在缬j氨酸和亮 氨酸的合成中催化二分子丙酮酸生成乙酰乳酸和二氧化碳，在异亮氨酸的合成中催化一分 子丙酮酸与一分子丁酮酸生成2-乙醛基-2-羟基丁酸和二氧化碳。若ALS活性受到抑制， 将造成支链氨基酸合成受阻，进而影响蛋白质合成及植物生长。
[0003] 近些年来，以ALS作为靶标已成为进行分子设计、开发超高效除草剂品种的重要 领域，现已开发出的ALS抑制剂类除草剂有5大类50余种：磺酰脲类（Sulfonylureas,SU)、 咪唑啉酮类（imidazolinones,IMI)、三唑啼陡类（triazolopyrimidines，TP)、啼陡水杨酸 类（pyrimidinylthio-benzoates,PTB)、石黄酉先胺类（sulfonylamino-carbonyl-triazolino nes，SCT)。这些ALS抑制剂类除草剂具有选择性强、杀草谱广、低毒高效等特点，其中具有代 表性的是咪唑啉酮类除草剂。此类除草剂主要应用于大豆等豆科作物的重要品种，对玉米、 小麦、水稻等禾本科作物的重要品种无选择性，并且在使用中，由于其土壤的长残留往往造 成后茬多种作物受害。随着抗性作物的选育成功，这个问题得到了解决。目前，已将抗性作 物与咪唑啉酮类除草剂使用组成一种"Clearfield生产体系"，即种植抗咪唑啉酮作物并使 用咪唑啉酮类除草剂来防治其他除草剂所不能防治的某些特殊杂草，如抗咪唑啉酮水稻田 的赤稻、油菜田的野油菜与其它十字花科杂草等。
[0004] 获得ALS抗除草剂突变体材料后，通过杂交、回交等常规育种方法，可将该抗除草 剂新品系的抗性基因导入其它对咪唑啉酮类除草剂无抗性的水稻品种或品系，提高导入目 标品种或品系对咪唑啉酮类除草剂的耐受性。若将抗性基因导入恢复系后，F1真杂种便具 有抗咪唑啉酮类除草剂特性，通过喷施除草剂可将各种类型的假杂种一次性全部杀死，提 高了制种效率和种子纯度。但是抗性性状为显性性状，F1代表现为咪唑啉酮抗性，从F2代 开始分离，在田间选育中需要开始每代喷施除草剂进行鉴定，如果除草剂剂量使用不当或 喷施不均匀极可能导致误选或所需要的材料死亡。另外，在抗除草剂基因研究过程中有时 需要保存不抗的材料，用作比较研究。为此，若能找到与抗性基因共显性的分子标记，从而 进行标记辅助选择，区分出育种材料中抗性基因的不同基因型，则可指导田间选育，加快育 种进程。
【发明内容】
[0005] 为了能更简便、更快速有效地检测出水稻材料中是否含有抗咪唑啉酮类除草剂基 因OsmALS突变体，并将其应用到抗性育种过程中，本发明提供了一种基于HRM技术，用于检 测水稻抗咪唑啉酮类除草剂基因OsmALS的第548位氨基酸突变的方法，所述OsmALS基因 的第548位氨基酸突变包括但不限于由Trp突变为Cys或Met，或是在该位置发生碱基的取 代、缺失或添加一个或几个核苷酸。所述的突变可以是点突变，也可以是DNA缺失或插入突 变。所述突变可以通过化学诱变或基因定点突变的方式获得，化学诱变的方法包括用EMS 等诱变剂处理所导致的诱变；基因定点突变的方法包括但不限于ZFN定点突变方法、TALEN 定点突变方法、和/或CRISPR/Cas9等定点突变方法。对该位点碱基突变检测方法的开发， 可以提高该基因在分子标记辅助选择育种，基因聚合育种，以及转基因育种中应用的效率。
[0006] 具体地，上述水稻OsALS基因的第548位氨基酸由Trp (TGG)突变为Met(ATG)的 点突变，该点突变后的OsmALS基因的DNA序列如SEQ ID NO: 1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。通过设计特定的检测引物，检测候选材料中该位置的碱基存在状态，具体通过 分析其HRM溶解曲线从而了解植株内源是否含有该突变，及所述突变为纯合还是杂合状态 的一种检测方法。
[0007] 本发明通过多轮实验，还优化出了一对用于OsmALS的第548位突变的HRM检测的 特定引物，所述引物编号及序列是：ALS-22415F:5' -AAGTATGTATGCGCCCT-3' ；ALS-22494R: 5' -GTGTTGAACAACCAACA-3'。
[0008] 本发明HRM检测方法采用10μL反应体系，包含1μLPCR模板，0. 5UrTaqDNA 聚合酶（Takara，Japan)，lXPCR缓冲液（含Mg2+)，250yMdNTP，0.ΙμΜ正向和反向引物 和 0· 1μL20XEvaGreen荧光染料（Biotium，USA)。PCR扩增程序为 95°C3min;94°C30s， 58°C30s，72°C10s，40 个循环；72°C5min，紧接着 95°C变性lmin，25°C复性lmin。为了防 止蒸发，体系务必滴加15μL矿物油覆盖。
[0009] 本发明所提供的HRM检测方法的实验步骤是：a)提取待测样本DNA;b)配制包含 待测样本DNA、引物对和EvaGreen荧光染料的PCR反应体系进行PCR扩增；和c)对PCR产 物进行HRM分析扫描。
[0010] 本发明还提供了一种提取植物细胞、组织、或器官中基因组DNA的方法，所述方法 包括：取适量植物细胞、组织或器官等材料，直接加提取液（10mMTris-HCl、0. 5mMEDTA、 0. 15MKC1)研磨，沸水浴10min后，静置分层取上清，即获得其基因组DNA，可作为HRM检测 中的PCR模板。
[0011] 本发明还提供了一种基于HRM技术的水稻OsmALS基因第548位突变检测PCR试 剂盒，其特征在于所述试剂盒包含引物对：正向引物：AAGTATGTATGCGCCCT(SEQIDN0:3); 和反向引物：GTGTTGAACAACCAACA(SEQIDN0:4)，用于检测ALS的Trp548Met突变。
[0012] 更具体的，本发明所提供的试剂盒进一步包含PCR试剂和荧光染料。
[0013] 本发明还提供了一种试剂盒的使用方法，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤： 提取待测样本DNA;配制包含待测样本DNA、引物对、PCR试剂盒和EvaGreen荧光染料的PCR 反应体系进行PCR扩增；和对PCR产物进行HRM分析扫描。
[0014] 具体地，本发明所述的检测水稻抗咪唑啉酮类除草剂基因OsmALS基因第548位 点突变分子标记的方法如下：通过使用引物对ALS-22415F和ALS-22494R对待检测材料的 基因组DNA进行PCR扩增；用LightScanner96等高分辨率熔解曲线分析仪器对前述PCR 扩增产物进行高分辨率熔解曲线采集后，所获得的与阳性对照水稻抗咪唑啉酮类除草剂基 因OsmALS呈一致的特异性峰型高分辨率熔解曲线，即可确定该材料具有水稻ALS基因的第 548位突变。
[0015] 所述引物对ALS-22415F和ALS-22494R的核苷酸序列如下所示：
[0016] ALS-22415F :5'-AAGTATGTATGCGCCCT-3'（SEQ ID N0:3);
[0017] ALS-22494R :5' -GTGTTGAACAACCAACA-3'（SEQ ID N0:4);
[0018] 所述的与水稻抗咪唑啉酮类除草剂基因OsmALS呈特异性峰型的高分辨率熔解曲 线具体如图2的红色曲线所示；在实际应用时，只需所检测样品的高分辨率熔解曲线与水 稻非转基因抗除草剂材料D3-10的高分辨率熔解曲线一致即可；
[0019] 所述的水稻抗咪唑啉酮类除草剂基因OsmALS基因的第548位突变的HRM检测方 法的开发，包括以下步骤：
[0020](1)通过多序列比对软件工具（如DNAMAN)，对野生型黄华占ALS基因（L0C_ 0s02g0510200)与水稻非转基因抗除草剂材料的OsmALS基因（的编码区第548位氨基酸对 应的核苷酸进行比对分析，筛查OsmALS基因的第548位氨基酸突变情况；
[0021] (2)利用步骤⑴获得的SNP信息，在该SNP上游36bp处设计基因特异性上游引 物，在该SNP下游44bp处设计基因特异性下游引物，引物对碱基序列如下：
[0022] ALS-22415F :5'-AAGTATGTATGCGCCCT-3'（SEQ ID N0:3);
[0023] ALS-22494R :5' -GTGTTGAACAACCAACA-3'（SEQ ID N0:4);
[0024] (3)以携带有水稻抗咪唑啉酮类除草剂基因OsmALS的咪唑啉酮类除草剂抗性材 料的总DNA为模板，进行PCR扩增，所获得的PCR产物用LightScanner96等高分辨率熔解 曲线分析仪器进行高分辨率熔解曲线采集后，得到与水稻抗咪唑啉酮类除草剂基因OsmALS 呈特异性峰型的高分辨率熔解曲线，即为水稻抗咪唑啉酮类除草剂基因OsmALS基因第548 位突变特异性分子标记；
[0025] 所述的水稻抗咪唑啉酮类除草剂基因OsmALS基因特异性分子标记548突变在鉴 别水稻材料咪唑啉酮类除草剂抗性基因的应用，特别适合