用于饲料中添加的双歧杆菌的快速定性、定量检测试剂盒及检测方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于畜牧兽医技术领域。更具体地，本发明涉及用于饲料中添加的双歧杆 菌的快速定性、定量检测试剂盒及检测方法和应用。
【背景技术】
[0002] 随着我国动物饲料中抗生素的禁用，新型的绿色添加剂的开发成为热点。目前益 生菌制剂不断发展，但是在其定性、定量检测的方法还不够科学和快速，这在一定程度上限 制了益生菌制剂的发展。通常采用生理生化反应和选择性培养基纯培养分离计数的传统方 法，极易因为菌种差异导致的检测效率受限、检测结果不稳定，除此之外，传统方法也会耗 费大量的时间和资源。实时荧光定量PCR相对于PCR技术来说，是定性到定量的飞跃，因其 特异性强、重复性好、准确和高效的特点成为分子生物学和微生物学领域非常重要的定量 检测方法。通过种属特异性PCR和实时荧光定量PCR技术，建立猪饲料中双歧杆菌的快速 定性、定量检测方法，可以提高检测效率、简化检测程序，并促进饲料行业和养殖业的发展， 为益生菌和饲料产业的快速和长远发展提供技术保障。
[0003] 本申请针对猪饲料中含有的双歧杆菌，通过对已经报道的双歧杆菌基因组序列的 比对分析，选取双歧杆菌的保守基因作为目的基因，自行设计双歧杆菌的基因序列的种属 特异性引物，利用该引物进行种属特异性PCR和实时荧光定量PCR，通过琼脂糖凝胶电泳图 谱分析和实时荧光定量PCR图谱分析，建立了猪饲料中双歧杆菌的快速定性和定量测定方 法。
【发明内容】
[0004] 用于饲料中添加的双歧杆菌的快速定性、定量检测试剂盒，包括引物： 5' -GTCATCTGCCCGACATCTACAA-3'、5' -TAGGCTTCAGAGCAACGCAAC-3'。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供了用于饲料中添加的双歧杆菌的快速定性、定量检 测试剂盒的检测方法，方法简单，重复性高，结果准确。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供了一种用于饲料中添加的双歧杆菌的快速定性、定 量检测试剂盒的应用。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0008] 用于饲料中添加的双歧杆菌的快速定性、定量检测试剂盒，包括引物： 5' -GTCATCTGCCCGACATCTACAA-3'、5' -TAGGCTTCAGAGCAACGCAAC-3'。
[0009] 用于饲料中添加的双歧杆菌的快速定性、定量检测试剂盒的检测方法，包括饲料 样品预处理的方法，该方法包括：
[0010] 经过充分粉碎混匀的饲料25g与225mL的灭菌生理盐水混合，在4°C以100转/分 的速度震荡l_2h，配成10%的均匀稀释液。对均匀稀释液进行10倍递增稀释，选择2个以 上适宜的稀释度，根据需要，提取细菌基因组DNA或RNA。
[0011] 用于饲料中添加的双歧杆菌的快速定性、定量检测试剂盒的应用，其应用包括利 用该试剂盒制备成用于双歧杆菌的检测试剂，或利用该试剂盒进行双歧杆菌的定性检测， 或利用该试剂盒进行双歧杆菌的定量检测，或利用该试剂盒同时进行双歧杆菌的定性和定 量的检测。与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0012] (1)本发明所采用的饲料样本的处理方法使得在益生菌的提取过程中，益生菌的 扩增有限，同时饲料中的益生菌又可以充分释放，这样所测得值才能真实的反应出饲料中 的益生菌数目，为一种特异的适用于饲料中双歧杆菌提取方法，为本发明首创。
[0013] (2)本发明对目前已经报道的双歧杆菌及饲料中可能添加的如嗜酸乳杆菌、植物 乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌等其他益生菌所有的基因组序 列进行了比对分析，选择了保守的单拷贝基因作为目的基因，并以该基因的保守序列设计 了特异性的引物，以该引物对饲料中的双歧杆菌进行定性、定量检测，所得到数据才能真实 的反应出饲料中添加的双歧杆菌的数量。
[0014] (3)本发明可以在不进行益生菌纯培养的基础上，简便、快速、准确地定性、定量 检测猪饲料中双歧杆菌，整个过程对饲料中双歧杆菌的检测程序简单、检测效率高、准确性 好，灵敏度高，最低检测标准要比传统的方法低的多，而且重复性好。
【附图说明】
[0015] 图1为双歧杆菌的定性检测示意图。
[0016] M:DL2000marker;1 :干酪乳杆菌；2 :嗜酸乳杆菌；3:保加利亚乳杆菌；4:屎肠球 菌；5:粪肠球菌；6:凝结芽孢杆菌；7:添加有动物双歧杆菌的饲料；8:阳性对照（含有目 的基因的质粒为模版）；9:动物双歧杆菌；10:大肠杆菌；11:乳酸乳球菌；12阴性对照
[0017] 图2为Real-timePCR对双歧杆菌引物特异性的验证示意图。
[0018] 其中A.嗜酸乳杆菌B.植物乳杆菌C.保加利亚乳杆菌D.干酪乳杆菌E.粪肠球 菌F.屎肠球菌G.双歧杆菌H.大肠杆菌
[0019] 图3为不同浓度双歧杆菌标准菌种扩增曲线示意图。
[0020] 其中A. 10 1稀释；B. 10 2稀释；C. 10 3稀释；D. 10 4稀释；E. 10 5稀释；F. 10 6稀释； G. 10 7稀释；H. 10 8稀释。
[0021] 图4为双歧杆菌定量检测标准曲线示意图。
【具体实施方式】
[0022] 本发明实施例所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。所用试剂或 材料，均已公开。
[0023] pMD18-T克隆载体核DH5α感受态细胞均购自Takara生物科技有限公司，Trizol 试剂是由Invitrogen公司专供提取的RNA的产品；DNaseI是TaKaRa公司产品；此过程中 使用的氯仿、异丙醇、无水乙醇等试剂是天津市化学试剂三厂生产的产品。双歧杆菌标准菌 种购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
[0024] 实施例1 :
[0025] 双歧杆菌目的检测基因的选取：
[0026] 本发明对目前已经报道的双歧杆菌及饲料中可能添加的如嗜酸乳杆菌、保加利亚 乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌等其他益生菌所有 的基因组序列进行了大量比对分析，选择定性、定量检测的目的基因，该目的基因在双歧杆 菌基因组中是保守的看家基因，而且是单拷贝基因，以该基因的保守序列设计了特异性的 引物，对饲料中的双歧杆菌进行定性、定量检测，所得到数据才能真实的反应出饲料中添 加的双歧杆菌的数量。针对该目的基因设计的引物为：5' -GTCATCTGCCCGACATCTACAA-3'、 5' -TAGGCTTCAGAGCAACGCAAC-3,该引物可用于双歧杆菌的定性及定量检测。
[0027] 实施例2 :
[0028] 用于饲料中添加的双歧杆菌的快速定性、定量检测试剂盒，包括引物： 5' -GTCATCTGCCCGACATCTACAA-3'、5' -TAGGCTTCAGAGCAACGCAAC-3。
[0029] 实施例：3 :
[0030] 用于饲料中添加的双歧杆菌的快速定性、定量检测试剂盒的检测方法，包括饲料 样品预处理的方法，该方法包括：
[0031] 经过充分粉碎混匀的饲料25g与225mL的灭菌生理盐水混合，在4°C以100转/分 的速度震荡l_2h，配成10%的均匀稀释液。无菌操作对上一步制备的均匀稀释液进行10 倍递增稀释，选择2~3个以上适宜的稀释度，根据需要，提取细菌基因组DNA或RNA。
[0032] 其余步骤利用实施例1中的引物对对提取的DNA或RNA进行定性和定量的鉴定。
[0033] 用于饲料中添加的屎肠球菌的快速定性、定量检测试剂盒的检测方法，具体包括 以下步骤：
[0034] A、模板DNA的制备
[0035] 无菌操作将经过充分粉碎混匀的饲料25g放入含有225mL的灭菌生理盐水的灭菌 广口瓶内，在低温条件下（4°C)以100转/分的速度震荡1.5h，配成10%的均匀稀释液。 无菌操作对上一步制备的均匀稀释液进行10倍递增稀释，选择3个以上适宜的稀释度，采 用液氮冻融-CTAB法抽提样品DNA:
[0036] (1)取预处理后的饲料样品于2.OmL离心管中，加入500μLTE缓冲液混合均匀 后，置于液氮中冻结，冻结后取出放在65°C中水浴5min，反复冻融4次；
[0037] (2)冻融结束后，往其中加入60.(^1^10%的303和10.(^1^11011^/1^蛋白酶1(， 37°C摇床以200r/min振荡4h;
[0038] (3)加入 100. 0μL5MNaCl和 100. 0μLCTAB/NaCl，65Γ中水浴lOmin;
[0039] (4)然后，加入与步骤（3)得到的溶液等体积的苯酚、氯仿和异戊醇混合物，它们 的体积比分别为25:24:1，混勾后以10000g/min离心lOmin,该溶液分成上层水相、中层固 相和下层有机相；
[0040] (5)吸取上层水相，加入与水相体积相等的苯酚、氯仿和异戊醇混合物抽提一次， 分离上清液；
[0041] (6)往上述上清液中加入1 %体积的3mol/L醋酸钠和1倍体积的并异丙醇，混匀 后室温静置30min, 10000g/min离心5min，弃掉上清；
[0042] (7)用70 %乙醇洗涤沉淀两次，室温下自然干燥后获得模板DNA，加入50. 0μL无 菌超纯水溶解DNA，-20°C保存备用。
[0043] 作为下一步定性PCR检测的模板，于_20°C下保存备用。
[0044] B、PCR扩增
[0045] 反应体系 25. 0μL:
[0046]
[0047] PCR反应条件：95°C预变性3min;95°C预变性30s，64°C退火30s，72°C延伸45s，循 环40次；72°C延伸lOmin，得到PCR扩增产物，在4°C下保存；
[0048] 取5. 0yLPCR产物使用1. 0 %的琼脂糖凝胶电泳进行检测。琼脂糖凝胶电泳图谱 分析是使用上海天能以商品名Tanon-4100凝胶电泳成像系统销售的仪器进行的；
[0049] 所述的双歧杆菌上下游特异性引物分别是：
[0050] 上游引物为：5' -GTCATCTGCCCGACATCTACAA-3'
[0051] 下游引物为：5 ' -TAGGCTTCAGAGCAACGCAAC-3 '
[0052] C、结果及判定
[0053] 检测时设以含有目的的扩增片段的质粒DNA作为模板为阳性对照，以灭菌水作为 模板为阴性对照；同时以各标准菌株的非同种对照菌株作为参考进行扩增。如果标准菌株 扩增产物出现与预期大小相符的特异性条带，而阴性对照和非同种对照菌株没有出现该特 异性条带，则表明引物是特异的。根据在256bp处出现预期特征条带，表明该饲料中含有双 歧杆菌，相反则不含有双歧杆菌。
[0054] 所述的含有目的基因的扩增片段的质粒DNA是通过将双歧杆菌的PCR产物与 PMD18T载体链接转化大肠杆菌DH5a获得的阳性克隆子。
[0055] 所述的定性检测是在5V/cm的电压下进行的电泳，时间约为20-30min，再用 Goldview染色，然后进行紫外照相。
[0056] D、RNA的提取
[0057] (1)样品总RNA的制备