光复粳水稻抗黑条矮缩病位点及分子标记方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及光复粳水稻抗黑条矮缩病位点及分子标记方法，属于农业科学技术领域。
【背景技术】
[0002]水稻黑条矮缩病是一种由水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarfvirus, RBSDV)引起的病毒病，主要以灰飞虱为传播介体进行传播。宿主有杂交水稻、常规水稻、大麦、小麦、玉米、小米、高粱、看麦娘、早熟禾、罔草、稗草、马塘等28种。水稻黑条矮缩病毒侵染玉米致其得玉米粗缩病，侵染小麦致其得小麦从矮病，这些病的病原形态、寄主及症状、介体昆虫及传病特性等都极其相似。水稻黑条矮缩病在水稻苗期、分蘖期、拔节期均可发病，因感染时期不同，病症略有差异，苗期与分蘖期最易感病，且发生较重。水稻黑条矮缩病的典型症状是病株矮缩，叶色浓绿僵硬，叶背、叶鞘和茎杆有早期蜡白色，后期为黑褐色的短条症状不规则突起，通常发病植株不抽穗或者极少结实，被喻为水稻“癌症”。
[0003]水稻黑条矮缩病首先在日本发现。60年代，水稻黑条矮缩病在日本大部分地区流行。我国黑条矮缩病最早于1963年在浙江省余姚县的早稻上发现，同时在上海市嘉定和奉贤县、江苏省苏州和镇江等地区的水稻上、扬州和南通等地区的玉米上有局部危害，主要影响华东地区。20世纪60年代水稻黑条矮缩病在我国华东诸省市大爆发后20年，由于麦田翻耕和早稻移栽等耕作方式的兴起，杀灭了第一代灰飞虱若虫，病害的初侵染受阻，致使发病面积逐年下降。80年代后，由于扩种小麦，又给本病初侵染创造了有利的寄主条件，致使本病在90年代再次大爆发，在浙江、上海、江苏、安徽、江西和福建省北部等长江中下游地区广泛发生，造成严重的经济损失。近年来，随着耕作制度和栽培方式的变化、农田生态多样、冬季气候变暖和感病品种的大面积推广，水稻黑条矮缩病在江苏、浙江、湖南等省大规模发生，主要危害杂交中稻、一季晚稻，通常损失稻谷二成以上，严重的甚至绝收。水稻黑条矮缩病在长江中下游地区、黄淮海地区的爆发，严重挫伤了稻农的种粮积极性，危害了我国粮食产业的安全。
[0004]目前，对水稻黑条矮缩病的防治主要是使用农药防治传毒介体灰飞虱，但由于介体昆虫种群数量大，导致防治效果不佳，且存在环境污染。而培育抗病品种是防治各类病害最为经济、有效的手段。筛选、发掘和创新抗病种质是开展抗病育种的前提和基础，而抗性基因定位和克隆，则为利用标记辅助选择等分子育种手段，加快和高效培育抗病品种提供了全新和有利工具。但迄今，对水稻黑条矮缩病抗性种质的筛选、抗性遗传基本特性还鲜有研究。进行水稻黑条矮缩病抗性QTL检测和遗传效应分析，可以为水稻黑条矮缩病的抗性遗传育种应用研究提供基础。
[0005]有关水稻黑条矮缩病的病原形态、寄主症状、介体昆虫及传播特性、发生特点、流行规律等已基本得到阐明，对水稻黑条矮缩病毒的核酸序列的测定和相关基因克隆也有报道。水稻黑条矮缩病遗传、育种研究目前基本处于起步状态，未能引起高度重视，可能是由于水稻黑条矮缩病20世纪60年代中期发生后近30年基本销声匿迹的原因。鉴于近年来水稻黑条矮缩病危害逐年加重，部分地区泛滥成灾，加强相关应用基础研究势在必行。目前水稻黑条矮缩病抗性基因的定位鲜有报道，可能是由于过去未能引起高度重视的原因，抗性基因定位目前基本都处于起步状态。
[0006]筛选、发掘和创新抗病种质是开展抗病育种的前提和基础，而抗性基因定位和克隆，则为利用分子标记辅助选择，加快育种进程奠定基础。迄今为止，在生产上也没有发现对RBSDV免疫的品种，所以对水稻黑条矮缩病抗性种质进行大规模筛选和展开水稻黑条矮缩病抗性定位研究显得尤为迫切。
[0007]目前常规水稻抗黑条矮缩病资源筛选抗病品种、抗病基因定位鉴定抗性家系均采用田间自然发病鉴定，即将各鉴定品种或品系小区形式种植于大田，每个小区几十株左右，大田常规栽培管理，传毒介体灰飞虱自然传毒，待水稻显现病症后调查各鉴定品种(家系)小区的穴发病率，以此为标准鉴别水稻品种(家系)的抗感能力的差异。然而，由于植物对天敌的抗性分为耐害性、抗生性和排趋性三种类别，各种抗性类别具由不同的抗性机理，水稻也不其外。不同水稻品种(家系)对灰飞虱排趋性的差异使得不同水稻品种(家系)的某些形态和生理等特性，表现出对灰飞虱的取食偏向的差异。而水稻黑条矮缩病的传毒介体正为灰飞虱，因此，通过自然鉴定方法鉴定得到的抗病水稻，可能实际上是抗虫(排趋性强)水稻而并非抗病水稻。然而，假若以该抗虫不抗病水稻育成品种进行病害区规模种植后，规模种植导致传毒介体被迫选择而使得水稻对灰飞虱排趋产生的假抗病表现消失，可能给农业生产带来较大的损失。
[0008]田间自然发病的不能排除灰飞虱排趋性的干扰，常规方法进行的抗病基因不够准确，因此，本研究小组改良了灰飞虱排趋性鉴定方法，采用田间自然鉴定与改良灰飞虱排趋性鉴定组合的方法，筛选到了抗水稻黑条矮缩病品种资源，并进一步准确定位了水稻黑条矮缩病抗病基因而排除了灰飞虱排趋的干扰，我们的研究对水稻黑条矮缩病抗病育种提供了重要的指导信息。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是针对常规育种中水稻黑条矮缩病抗性鉴定稳定性、重复性较差及费时费力等缺点，提供了光复粳水稻抗黑条矮缩病位点及分子标记方法，该方法可以预测植株对水稻黑条矮缩病的抗性，简化了选择方法，进而加快抗病品种的育种进程。
[0010]本发明的目的可通过如下技术方案实现:
光复粳水稻抗黑条矮缩病位点及分子标记方法，其特征在于:用分子标记RM6082引物:SEQ ID N0.1/SEQ ID N0.2，或者用自行合成的分子标记05-22引物:SEQ ID N0.3/SEQID N0.4扩增水稻抗黑条矮缩病鉴定材料，如果用分子标记RM6082引物:SEQ ID N0.1/SEQ ID N0.2能够扩增出147bp的扩增片段，或用自行合成的分子标记05-22引物:SEQ IDN0.3/SEQ ID N0.4能够扩增出265bp的扩增片段，则标志着水稻材料内存在抗黑条矮缩病位点 qRBSDV19o
[0011 ] 该方法包含以下步骤:
(1)以水稻黑条矮缩病抗源光复粳为母本，水稻黑条矮缩病高感品种扬农粳2号为父本，配制杂种F1，构建了包含282个单株的F2分离群体，F2单株自交获得F2:3家系；
(2)对F2:3家系采用田间自然鉴定与改良灰飞虱排趋性鉴定组合的方法，进行水稻黑条矮缩病抗病性鉴定；
(3)亲本、F1及F2:3定位群体单株的DNA采用TPS粗提法提取；
(4)用实验室已有的大体平均分布于水稻12条染色体的308对SSR引物(含59对自行合成引物)，对亲本、F1及F2:3定位群体进行PCR扩增寻找两两之间同时具有稳定多态性的引物，用筛选到的多态性分子标记检测F2:3家系；
(5)根据定位群体各单株分子标记多态性检测结果，并结合其抗性表型参数，用Mapmaker/Exp3.0软件进行基因和分子标记位点的遗传连锁分析，利用Kosambi作图函数将交换率转换为遗传距离(CM);
(6)采用基于复合区间作图法软件WindowsQTL Cartographer V2.5检测水稻黑条矮缩病的抗性QTL，L0D值的阈值定为2.0，按P = 0.005概率值检测抗性QTL的数目及其在染色体上的位置；
(7)获得水稻黑条矮缩病抗性品种光复粳抗黑条矮缩病基因位点qRBSDV19，位于第5号染色体分子标记RM6082与自行合成的分子标记05-22之间，通过检测第5号染色体上该两个引物标记的带型数据，可以预测该植株对水稻黑条矮缩病的抗性，大大提高抗黑条矮缩病水稻的选择效率。
[0012]所述的采用田间自然鉴定与改良灰飞虱排趋性鉴定组合的方法进行水稻黑条矮缩病抗病性鉴定的具体方案为:
(1)待鉴定材料大田小区种植，采用水育手工移栽法，每品种单本移栽60-120株，秧田期和大田移栽早期均不防治灰飞虱，其他时间按当地生产常规管理，水稻移栽活棵后调查基本苗，水稻分蘖高峰期调查每份材料水稻黑条矮缩病发病率A ；
(2)将催芽后的水稻种子播于65cmX44cmX14cm的塑料周转箱内，每份材料1行，每行10株，待幼苗长至1.5-2.0叶，按每株10头接入3-4龄的灰飞虱若虫，每天上午8时、下午4时调查每个单株上的虫数，每次调查后进行驱虫，使其尽量均匀分布，环境温度保持在26±2°C，自然光照，5天后计算每份材料每个单株上的平均虫数，作为排驱性测验值，进一步按照每份材料单株平均虫数/整个家系单株平均虫数计算相对排趋性指数B ;
(3)根据经验计算公示计算每份材料水稻黑条矮缩病抗病指数C:C=1-A/ V B，以抗病指数C作为定位群体的抗性表型参数。
[0013]所述的扩增黑条矮缩病位点qRBSDV19的分子标记引物选自分子标记RM6082引物:SEQ ID N0.1/SEQ ID N0.2 和自行合成的分子标记 05-22 引物:SEQ ID N0.3/SEQ IDN0.4。
[0014]所述的对亲本、FI及F2:3定位群体进行PCR扩增的PCR反应体系为:总体积为20μ?，反应液组成为 10XPCR buffer(200mmol/L Tris-HCl pH8.4,500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2，stabilizers)2PL，10mmol/L dNTPs 1.2μ?，引物各50ng，基因组DNA50ng，1.0U TaqDNA聚合酶，补水至20μ? ;PCR扩增程序为:94°C预变性5min ;94°C变性lmin，50°C退火复性lmin，72°C延伸50_90s，共35个循环；最后72°C保温lOmin ;扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)银染检测。
[0015]本发明所提供的光复粳水稻抗黑条矮缩病位点及分子标记方法，具有以下优点:
(1)本发明采用田间自然鉴定与改良灰飞虱排趋性鉴定组合的方法进行水稻黑条矮缩病抗病性鉴定，其鉴定结果排除了灰飞虱排趋性的干扰，表型鉴定方法更加准确可信； (2)本发明分子标记定位的抗性基因位点位置明确，鉴定方便。本发明通过检测5号染色体上与水稻黑条矮缩病抗性QTL紧密连锁的SSR标记，即可以预测水稻植株的黑条矮缩病抗性水平，大大提高了抗黑条矮缩病水稻的选择效率，加快了育种进程。
【附图说明】
[0016]图1所示5号染色体上与水稻黑条矮缩病抗性QTL紧密连锁的SSR标记在染色体上的位置。
[0017]图2所示应用5号染色体上与水稻黑条矮缩病抗性QTL紧密连锁的SSR标记预测植株水稻黑条矮缩病抗性的电泳图谱。M:Mark ；1:光复粳；2:扬农粳2号；3:F1 ；4~12:抗病单株；13_20