一种与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记、其获取方法及应用

文档序号:9592935阅读:289来源:国知局
一种与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记、其获取方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于家禽基因工程的技术领域,更具体地,涉及一种与高邮鸭育成中期体 重、胸肌增长相关的分子标记、其获取方法及应用。
【背景技术】
[0002] 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)又称⑶F-8,属TGF-β超家族,是1997年发现 的一种骨骼肌生长发育的负调控因子,其活性的丧失或降低,会引起动物肌肉的过度发育, 表现为双肌性状。MSTN在骨骼肌中广泛表达的糖蛋白,其功能和表达量的变化可能会通过 调节靶蛋白的表达来改变肌肉的纤维组成及造成肌肉重量的变化。MSTN对骨骼肌的生长有 调节作用,其基因在猪、人、绵羊和牛已被定位和标记,但在家禽尤其是水禽育种过程中的 研究及利用则相对缺乏研究和探索。
[0003]单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP),主要是指在基因组水 平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP作为第三代分子标记,具有数量 多、分布广、代表性强和遗传稳定性好等特点。目前已经在动植物的遗传多样性分析、基因 作图、分子标记辅助育种和功能基因学的研究中得到了广泛的应用。结合PCR技术、电泳、 荧光等方法的SNP检测方法,在动植物遗传育种中起到重要作用。高邮鸭是全国三大名鸭 之一,生长发育快,肉质好,属于肉蛋兼用型地方品种。在育种工作中,与改变个体遗传特性 (人工诱变)相比较,改变品种遗传结构相对容易。而现有技术中尚未发现与高邮鸭育成中 期体重、胸肌增长相关的分子标记与应用。

【发明内容】

[0004] 为了解决现有技术存在的不足,本发明提供了一种与高邮鸭育成中期体重、胸肌 增长相关的分子标记、其获取方法及应用。
[0005] 本发明提供了一种与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记,所述分子 标记位于SEQIDNO: 1所示核苷酸的第185位,该位点的核苷酸为C或T。
[0006] 本发明还提供了一种获取与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记的方 法,PCR扩增高邮鸭基因组DNA,扩增产物经连接酶检测反应后测序,通过序列分析获取与 高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记。
[0007]其中,PCR扩增所用引物对序列如SEQIDN0:2和SEQIDN0:3所示。
[0008] 其中,连接酶检测反应所用探针序列如SEQIDN0:4、SEQIDN0:5和SEQIDN0:6 所示。
[0009] 其中,连接酶检测反应产物长度lOlbp的为基因型CC,连接酶检测反应产物长度 103bp的为基因型TT,连接酶检测反应产物长度101bp和103bp的为基因型CT。
[0010] 本发明还提供了一种与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记在筛选高 邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关性状中的应用。
[0011] 本发明的有益效果:本发明提供了一种与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的 分子标记,针对该分子标记单核苷酸多态性,设计特定的引物扩增包含SNP位点的基因片 段,然后进行连接酶检测反应,测序分析,能够简单、快速、低成本、精确地检测其单核苷酸 的多态性。对上述SNP位点的基因型与高邮鸭育成中期体重、胸肌增重进行关联分析,可以 用于家系选育中的早期选择,也可在选配中提供分子依据。本发明分子标记为筛选高邮鸭 育成中期体重、胸肌增长相关性状提供了新的方法。
【附图说明】
[0012] 图1是ABI3730型基因分析仪检测与Genemapper分析结果。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合实施例对本发明进行详细地解释说明。
[0014] 本发明的与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记,所述分子标记位于 SEQIDNO: 1所示核苷酸的第185位,该位点的核苷酸为C或T,导致该基因位点的单核苷 酸多态性,该核苷酸序列为鸭MSTN基因的部分基因组序列。
[0015] 针对上述第185位的单核苷酸多态性,本发明还公开了其获取的方法,其中用于 扩增所述MSTN基因和检测该基因位点突变的正反向引物对序列如SEQIDNO:2-3所示。
[0016] 其中用于对上述扩增产物进行连接酶检测反应(LDR),所需的LDR探针序列如SEQ IDN0 :4-6 所示。
[0017] 本发明的与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记用于筛选高邮鸭体 重、胸腿肌重和胸肌肌纤维性状。
[0018] 本发明的获取与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记的方法,包括以 下步骤:
[0019] 1、鸭血样的采集
[0020] 本发明的试验鸭来自江苏省高邮鸭集团,在相同的日粮水平下饲喂的同日龄高 邮鸭种鸭群。采用一次性注射器从鸭翅下静脉中抽取lml血液,注入经高压灭菌并装 有200μ1 2%无菌的乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂的1.5ml离心管中,轻轻摇匀,记录翅 号,-80 °C保存备用。
[0021] 2、DNA的提取
[0022] 基因组DNA的抽提采用苯酚-氯仿抽提法
[0023] (1)取上述全血30μ1置于1.5ml离心管,分别加入470μ1 1XSET缓冲液、 12. 5μ1 20%SDS(十二烷基硫酸钠)和6μ1的10mg/ml蛋白酶Κ,混合均匀后放于55°C 水浴过夜;
[0024] (2)取出样本于1. 5ml离心管,加入500μ1饱和苯酚,轻摇20min,lOOOOrpm离心 10min;
[0025] (3)取上清,再次加入500μ1饱和苯酸,轻摇20min,lOOOOrpm离心10min;
[0026] (4)取上清,加入500μ1氯仿-异戊醇(23 :1)轻摇20min,lOOOOrpm离心10min;
[0027](5)取上清,加入lml冰无水乙醇(-20°C),来回摇摆以沉淀DNA,lOOOOrpm离心 10min后倒出乙醇;
[0028] (6)用1ml75%乙醇清洗DNA-次,倒掉乙醇,置于50°C干燥箱内烘干;
[0029] (7)待DNA完全干燥后加入300μ1灭菌后的双蒸水溶解,50°C水浴锅中过夜以溶 解DNA;将DNA原液1 :100稀释并进行分光光度计检测浓度,0D值为1. 85-1. 94。
[0030] (8)将DNA浓度稀释到50ng/μ1,存放于-20°C冰箱中保存备用。
[0031] 3、PCR扩增
[0032] 扩增包含C185T位点的片段:根据GenBank的鸭基因组中MSTN基因 (NW_004676457)全序列设计包含该位点的正反向引物,由上海生工生物工程技术服务有限 公司合成。以上述高邮鸭基因组为模板,在包含待测位点序列的正反向引物、TaqDNA聚合 酶、缓冲环境、dNTPs存在的情况下,在PCR反应条件下进行扩增,PCR产物大小为207bp,用 于LDR反应。
[0033] 所述引物对序列如下:
[0034] 上游引物序列为:5'-AGCCATCGCTACTGTCGTCT-3'(SEQIDNO:2);
[0035] 下游引物序列为:5'-ATGGACTGTGCAATGCTTGT-3'(SEQIDNO:3)
[0036] PCR扩增反应的具体步骤为:
[0037] 1)PCR扩增反应体系准备:50ng/μ1DNA模板 1μl、2mMdNTP2μl、3mM Mg2+0. 6μ1、10XPCR反应缓冲液2μ1、10μΜ上下游引物各0. 4μ1、1U/μ1Taq聚合酶 0. 2μ1,加ddH20 至总体积 20μ1。
[0038] 2)PCR扩增反应程序设置:在Perkin-ElmerGeneAmpPCRSystems9600 上进 行扩增反应,PCR扩增反应程序为:95°C变性2min,40次循环(94°C90s,50°Clmin30s, 65°C30s)65°C延伸lOmin,得到PCR扩增产物。
[0039] 3)反应结束后,取2μ1反应产物在3. 0%琼脂糖胶,0. 5XTBE中电泳,检测反应是 否成功,剩余反应产物在_20°C的条件下保存。
[0040] 4、连接酶检测反应(LDR)
[0041] 设计三条LDR探针,然后进行LDR反应
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