Pik3ca基因突变核酸检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种核酸检测领域，具体涉及一种PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] PIK3CA基因是由Volinia在1994年利用原位杂交技术检测到的，其定位于 3q26. 3,长34kb，包含21个外显子，编码1068种氨基酸，该组氨基酸产生一组长124kD的蛋 白。PIK3CA基因是PI3K家族中唯一发现存在实体瘤突变的基因。PIK3CA已被证实是一种癌 基因，并且发现PIKCA基因是发生体细胞突变的唯一基因，其突变包括基因的扩增、缺失和 体细胞性的错义突变等，多个研究均提出PIK3CA的突变约4/5发生在螺旋区（ex〇n9)和激 酶区（eX〇n20)这两个热点区域。研究发现，约30%的人类实体肿瘤中存在癌基因PIK3CA的 突变，其突变的比例在结肠癌、成胶质细胞瘤、胃癌、乳腺癌和肺癌中分别约为32 %、27 %、 25%、8%和4%，然而在胆道系统的肿瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤中，PIK3CA的突变则比较 少见。
[0003] PIK3CA基因突变的乳腺癌会对抗EGFR(EpidermalGrowthFactorReceptor，上 皮生长因子受体）的治疗，产生耐药性。目前已发现在多种癌症中（如乳腺癌、非小细胞肺 癌等）存在PIK3CA基因突变，PIK3CA基因突变导致PI3K/Akt信号通路持续性活化。PI3K 作为EGFR下游信号分子被激活，导致肿瘤细胞对EGFR-TKI等药物的耐药性。因此，医生可 将PIK3CA基因突变的检测结果作为参考，在乳腺癌患者、非小细胞肺癌患者以及结直肠癌 患者中选择出适合相关靶向药物治疗的人群，避免药物浪费。
[0004] 随着人类医学和药物研究水平的提高，药理遗传学（Pharmacogenetics)日渐兴 起。研究表明，药物在体内的代谢、药物治疗的有效性以及副反应、甚至患者的预后都存在 个体差异，受患者基因背景的影响。因此，应用药理遗传学，在基因水平上研究药物作用的 个体差异，使得个性化治疗这一新一代医学概念成为可能。对药物作用相关基因的检测，可 指导医生对患者准确施药，规避药物副作用，同时提高病人乃至社会的医疗费用效率。
[0005] 荧光定量PCR(聚合酶链式反应）技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发 展起来的一种更灵敏、更特异、更精确的核酸检测技术。检测结果准确，重复性高，能动态反 应患者治疗前、后病原体动态变化及与临床的关系，且整个过程中避免了传统PCR需后处 理的问题，减少了污染。实时荧光定量PCR技术使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪， 荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号， 通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软 件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点（即Ct值）以及扩增曲线的 形状，可以判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可以通 过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值（即定量检测）。与传统的PCR 相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针 结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效应；如果扩增过程 中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，荧光报告基团 与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发出的荧光信号被 荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试验 结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果和样本浓度 的定值结果。随着荧光PCR技术的发展，其在PIK3CA基因突变诊断领域的应用已越来越广 泛，也越来越为人所重视，PIK3CA基因突变的实验诊断中，实时荧光PCR技术凭借着快速、 敏感、特异等优点显示出了其临床诊断的优越性。
[0006] 等位基因特异PCR(ARMS-PCR)的基本原理是，TaqDNA聚合酶缺少3 - 5外切酶活 性，在一定条件下PCR引物3末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变，设计 适当的引物可以通过PCR方法直接达到区分突变型和野生型基因的目的。
[0007] 国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术与ARMS-PCR技术检测PIK3CA基因突变 的试剂盒应用于临床检测中，然而，现有技术中的试剂盒具有诸多不足之处：1)对于野生 型背景的耐受能力差，经常出现假阳性；2)没有设置阳性内对照，无法监控假阴性；3)没有 预防PCR产物污染的措施，因此，现有技术中的试剂盒的检测效果较差。
【发明内容】
[0008] 本发明提供一种PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒，以解决现有技术中的试剂盒 的检测效果较差的技术问题。
[0009] 本发明提供所述PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒包括：PCR反应液，所述PCR反 应液包括E542K突变检测反应液、E545K突变检测反应液、E54?突变检测反应液、H1047R 突变检测反应液、H1047L突变检测反应液和H1047Y突变检测反应液，且上述6种检测反应 液均包括用于靶多核苷酸扩增的上下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。
[0010] 优选的，所述E542K突变检测反应液中用于靶多核苷酸扩增的上下游引物的碱基 序列为：
[0011] 上游引物：5' -CAATTTCTACACGAGATCCTCTCTCTA-3' ；
[0012] 下游引物：5' -CAGAGAATCTCCATTTTAGCACTTACC-3'。
[0013] 优选的，所述E545K突变检测反应液中用于靶多核苷酸扩增的上下游引物的碱基 序列为：
[0014] 上游引物：5 ' -CACGAGATCCTCTCTCTGAAATCACTA-3 ' ；
[0015] 下游引物：5 ' -CAGAGAATCTCCATTTTAGCACTTACC-3 '。
[0016] 优选的，所述E54?突变检测反应液中用于靶多核苷酸扩增的上下游引物的碱基 序列为：
[0017] 上游引物：5' -GAGATCCTCTCTCTGAAATCACTGAT-3' ；
[0018] 下游引物：5 ' -CAGAGAATCTCCATTTTAGCACTTACC-3 '。
[0019] 优选的，所述E542K突变检测反应液、E545K突变检测反应液和E54?突变检测反 应液中所述用于靶多核苷酸检测的探针的碱基序列均为：5'FAM-CAGGAGAAAGATTTTCTATGGA GTCACAGGTAAGT-BHQ13'。
[0020] 优选的，所述H1047R突变检测反应液中用于靶多核苷酸扩增的上下游引物的碱 基序列为：
[0021] 上游引物：5' -ATGAAACAAATGAATGATGCACG-3' ；
[0022] 下游引物：5 ' -GAGCTTTCATTTTCTCAGTTATCTTTTC-3 '。
[0023] 优选的，所述H1047L突变检测反应液中用于靶多核苷酸扩增的上下游引物的碱 基序列为：
[0024] 上游引物：5 ' -TCATGAAACAAATGAATGATGCTCT-3 ' ；
[0025] 下游引物：5 ' -GAGCTTTCATTTTCTCAGTTATCTTTTC-3 '。
[0026] 优选的，所述H1047Y突变检测反应液中用于靶多核苷酸扩增的上下游引物的碱 基序列为：
[0027] 上游引物：5 ' -TCATGAAACAAATGAATGATGCAT-3 ' ；
[0028] 下游引物：5 ' -GAGCTTTCATTTTCTCAGTTATCTTTTC-3 '。
[0029] 优选的，所述H1047R突变检测反应液、H1047L突变检测反应液和H1047Y突变检 测反应液中所述用于靶多核苷酸检测的探针的碱基序列均为：5'FAM-ATGGTGGCTGGACAACAA AAATGGATT-BHQ13'。
[0030] 优选的，所述E542K突变检测反应液、所述E545K突变检测反应液、所述E54?突 变检测反应液、所述H1047R突变检测反应液、所述H1047L突变检测反应液和所述H1047Y 突变检测反应液内均含有用于内标片段扩增的上下游引物和用于检测内标的探针，其中， 所述上下游引物和所述探针的碱基序列分别为：
[0031] 上游引物：5' -GTAATTGCTGAAGCAATCAGGAAA-3' ；
[0032] 下游引物：5 ' -ACTTGCCCTGATATTCTAAAACACAG-3 ' ；
[0033] 探针：5' -HEX-AACTCGAAGTATGTTGCTATCCTCTGAACAACTAA-BHQ1-3' ；
[0034] 所述内标片段的碱基序列为：5'-ACCAGAACAAGTAATTGCTGAAGCAATCAGGAAAAAAACTC GAAGTATGTTGCTATCCTCTGAACAACTAAAACTCTGTGTTTTAGAATATCAGGGCAAGTATATT-3,〇
[0035] 优选的，所述E542K突变检测反应液、所述E545K突变检测反应液、所述E54?突 变检测反应液、所述H1047R突变检测反应液、所述H1047L突变检测反应液和所述H1047Y 突变检测反应液内均含有10XPCR反应缓冲液和脱氧核糖核苷三磷酸，其中，所述10XPCR 反应缓冲液包括：200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、30mmol/L的氯化镁溶液、 500mmol/L的氯化钾溶液、体积百分比为0. 2%的曲拉通溶液和体积百分比为10%的甲酰 胺溶液；所述脱氧核糖核苷三磷酸包括：dATP、dCTP、dGTP、dUTP或dTTP。
[0036] 优选的，所述PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒中还包括酶混合液，所述酶混合液 中包括耐热DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶。
[0037] 优选的，所述PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒还包括PIK3CA阳性对照和PIK3CA 阴性对照。
[0038] 本发明的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：
[0039] 本发明提供一种PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒，所述PIK3CA基因突变核酸检