一种基于微生物群落产酸指数的固态酿造食醋发酵过程监测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物发酵领域，具体涉及一种基于微生物群落产酸指数的固态酿造食 醋发酵过程监测方法。
【背景技术】
[0002] 我国食醋的生产历史悠久，酿造工艺为多菌种混合发酵工艺，通过多种微生物的 代谢作用产生风味饱满、酸味柔和的食醋。食醋的生产中有两个主要的发酵阶段：酒精发 酵和醋酸发酵。在酒精发酵阶段，淀粉质原料如糯米、高粱等经过霉菌和酵母菌的一系列代 谢，最终生成酒精；而在醋酸发酵阶段决定食醋风味和品质的关键步骤，该过程是由众多微 生物共同参与发酵，将乙醇转化为酸类等众多风味物质，因此微生物菌群是固态酿造食醋 广品风味品质的保证。
[0003] 目前，我国众多食醋生产厂家的食醋发酵过程控制都以传统的操作经验为主，主 要按照固定的发酵方法和发酵时间进行操作，发酵过程中仅对温度、风味感官进行检测，而 对于固态醋酸发酵过程的结束终点的判定则依赖于总酸、不挥发酸等代谢物含量等理化指 标，因此整个固态醋酸发酵过程可控性不高。醋醅中的总酸、不挥发酸、挥发性风味物质等 均为酿醋微生物菌群代谢活动的结果，因此通过总酸等代谢物指标来跟踪食醋固态发酵过 程往往具有滞后性，一旦发现总酸、不挥发酸含量偏低则难以在发酵过程中进行工艺的及 时调整，从而导致产品品质存在批次差异，尤其是产品风味差异较大的现象时有发生。中仅 监测总酸、不挥发酸含量，未能够根据发酵过程中微生物的变化情况进行工艺参数的及时 调整，另外，而总酸、不挥发酸、风味物质等均为微生物的代谢产物，与微生物的变化过程相 比其存在滞后性。
[0004] 随着微生物群落高通量测序技术的迅速发展，人们可以快速地从基因水平上来研 究特定环境中微生物的种类、数量和功能，这在很大程度上有助于人们了解复杂微生物环 境的信息。国内外很多研究人员把高通量测序技术运用到对粪便、土壤、海底污泥、污水等 体系中原核生物和真核生物的微生态研究中，同时在传统发酵食品领域也有非常广泛的应 用，其中包括墨西哥发酵玉米团、日本黑醋、朝鲜泡菜、奶酪意大利香肠等的微生物组成和 分布的研究，取得了令人瞩目的成果，为我们更好地了解国内外传统发酵的机理提供了理 论基础，同时也为传统发酵行业的改革和进步提供了宝贵的理论数据支撑。
[0005] 本发明提供了一种基于微生物群落产酸指数的固态酿造食醋发酵过程的监测方 法。该方法采用高通量测序技术对固态发酵过程中间的醋醅微生物群落结构进行测定，然 后利用与总酸形成相关的微生物相对丰度数值来计算微生物群落产酸指数，并代入醋醅总 酸预测方程计算该醋醅样品的总酸含量预测值，通过与醋醅总酸标准变化曲线比较后便能 够知道该批次发酵过程是偏快还是偏慢，并根据结果可以及时调整发酵工艺参数，并及时 判定和预测发酵结束时间。。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于解决上述现有食醋固态酿造工艺可控性以及批次质量不稳定 的不足，提供了一种从微生物产酸机制出发通过微生物群落产酸指数的方法来监控食醋固 态发酵的正常进行，该方法准确度较高，为我国固态食醋酿造行业由"经验型"控制向"科技 型"转变奠定了理论基础。
[0007] 本发明通过以下方案实现：首先对固态发酵食醋发酵过程中的醋醅样本进行采 样，并对醋醅样本中的微生物群落总DNA进行提取，通过高通量测序技术对样本基因组的 遗传发育标记16SrDNA的V1-V3区进行高通量测序，将醋醅微生物群落中与醋醅总酸形 成有密切相关性的微生物相对丰度数值代入微生物群落产酸指数计算方程，并将计算所得 的产酸指数代入醋醅总酸含量预测方程，从而获得醋醅总酸含量的预测值。醋醅总酸预测 值与醋醅总酸变化标准曲线进行比较，从而可以判断和预测该批次固态发酵食醋的实际进 度，并指导食醋发酵参数的调整。该方法通过监测醋醅中与产酸相关的微生物丰度来对食 醋酿造过程进行监控，对产酸的预测准确度较高，对控制食醋品质有很好的监控作用，具体 实施路线如下：
[0008] (1)醋醅微生物群落总DNA的提取：从酿醋厂取样醋醅样品100g，在无菌塑封袋中 充分混匀后取5g醋醅，通过液氮研磨、溶菌酶处理、氯仿-异戊醇抽提、乙醇洗涤、RNaseA消 化等步骤提取醋醅中微生物群落的总DNA。
[0009] (2)醋醅微生物群落的高通量测序分析：对微生物群落总DNA中16SrRNA基因 V1-V3区序列进行扩增，扩增产物纯化后进行定量。所有扩增产物等比例混合后在测序仪上 进行高通量测序，测序产物平均长度为500bp。测序分析完成后获得各类微生物在整个微生 物群落中的相对丰度。
[0010] (3)微生物群落产酸指数的计算：将醋醅微生物群落中与醋醅总酸形成有正相关 关系的微生物（Acetobacter、Acinetobacter)以及与醋醅总酸形成具有负相关的微生物 (Lactobacillus、Xanthomonas、Sphingomonas、Rhizobium、Pantoea、Methylobacterium、 Staphylococcus)的相对丰度代入微生物产酸指数计算方程，获得微生物群落产酸指数。
[0011] (4)醋醅总酸含量的预测：将上述步骤（3)中计算获得的微生物群落产酸指数代 入醋醅总酸含量预测方程，从而可以根据微生物的相对丰度来预测醋醅总酸含量。
[0012] (5)固态酿造食醋发酵过程的判定：将上述步骤⑷获得的醋醅总酸预测值与醋 醅总酸变化标准曲线进行比较，从而可以判断和预测该批次固态发酵食醋的实际进度，并 指导食醋发酵参数的调整。
[0013] 本发明提供了一种基于微生物群落产酸指数的方法来监测食醋固态发酵的发酵 进程。通过测定微生物群落的相对丰度并计算产酸指数从而判断发酵进程是偏慢、正常还 是偏快，能够预测发酵的趋势，有助于及时调整工艺参数，并且提前判定发酵结束时间。
【附图说明】：
[0014] 图1固态酿造食醋醋醅微生物群落DNA焦磷酸测序的序列长度分布
[0015] 图2醋醅总酸含量标准变化曲线
【具体实施方式】
[0016] 镇江香醋醋酸发酵阶段是典型的固态发酵过程，下面以镇江香醋醋酸发酵过程为 例对本发明做进一步的说明。
[0017] 实施例1:醋醅微生物群落总DNA的提取
[0018] 1、样品采集：采集食醋发酵过程中不同时间点的醋醅样品，样品采集后如不能及 时提取DNA应立即进行冷冻处理。
[0019] 2、醋醅中微生物总DNA提取方法：称取5g醋醅，在研钵中加入液氮充分研磨，转 移至50mL离心管。向离心管中加入13. 5mLDNA抽提缓冲液和100μL溶菌酶（50mg/mL)， 于225rpm摇床上37°C摇动30min。向离心管中加入1.5mL10%SDS，65°C水浴2h，每隔 15-20min轻轻颠倒几下，室温6000Xg离心lOmin。收集上清；用等体积的氯仿-异戊醇 (24:1，V/V)抽提一次，以0. 6倍体积的异丙醇室温沉淀1h，16000Xg离心20min，收集沉 淀，用预冷的70 %乙醇洗涤沉淀，DNA沉淀干燥后溶于100μLTE中，加入终浓度为0. 5μg/ mLRNaseA，并在37°C下水浴消化2h，以去除RNA，用1. 5%琼脂糖凝胶电泳验证DNA提取的 效果，如果在l〇kb左右出现条带，则DNA提取成功。
[0020] 实施例2 :16SrRNA高通量测序分析醋醅微生物群落结构
[0021] 1.barcode-PCR扩增
[0022] 细菌16S rDNAVfV^PCR扩增所用的引物可以扩增16S rDNA乂^乂返约500bp 的片段，对应E. coli 16S rDNA 5到534的位点。为方便测序后序列的提取，每个样本对应 一个含有7个碱基的barcode序列，即在引物一端加上barcode片段，序列如下：
[0023] Forward: 5 ' -XXXXXXX-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '
[0024] Reverse:5，-XXXXXXX-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3，
[0025] barcode-PCR采用25μL体系，具体如下：
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[0027] barcode-PCR的反应条件具体如下：
[0028]
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