检测鲍曼不动杆菌耐药性的引物、试剂盒及其方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因检测领域，具体而言，涉及检测鲍曼不动杆菌耐药性的引物、试剂 盒及其方法。
【背景技术】
[0002] 鲍曼不动杆菌具有强大的获得耐药性和克隆传播的能力，多重耐药、广泛耐药、全 耐药鲍曼不动杆菌呈世界性流行。据2010年中国CHINET细菌耐药性监测网数据显示，我 国10省市14家教学医院鲍曼不动杆菌占临床分离革兰阴性菌的16. 11%，仅次于大肠埃希 菌与肺炎克雷伯菌，已成为我国院内感染的最重要病原菌之一。此外，鲍曼不动杆菌具有在 体外长期存活能力，易造成克隆播散。故鲍曼不动杆菌尤其是耐药性鲍曼不动杆菌防控已 成为保障医疗质量和医疗安全，保障广大患者的生命安全和健康权益所需要迫切解决的问 题。
[0003] 目前鲍曼不动杆菌耐药诊断的金标准是基于培养-药物敏感性测试的方法。简 单的说，先将标本按照常规培养方法，在孵箱中进行18-24小时孵育，再将获得的纯菌落制 成菌悬液，将菌悬液涂布在M-Η培养基平板上，使用药敏纸片贴于细菌平板表面，再次放置 在孵箱中进行24小时孵育，量取抑菌圈直径，根据美国临床实验室标准化协会表中进行判 断；或者在获得菌悬液后，采用VITEK2C0MPACT全自动微生物鉴定及药敏分析系统进行菌 种鉴定于药敏结果读取，该步骤也需耗时约24小时。
[0004] 因此，现有技术存在以下缺点：
[0005] 方法一为细菌药敏判断金标准，耗时长，且对实验技术人员要求高，适合对鲍曼不 动杆菌药敏的精细诊断；方法二对实验人员要求较低，但实验成本高。
[0006] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0007] 本发明的第一目的在于提供一种检测鲍曼不动杆菌耐药性的引物，该引物特异性 强，敏感度高，重复性好。
[0008] 本发明的第二目的在于提供一种检测鲍曼不动杆菌耐药性的试剂盒，以便于检测 鲍曼不动杆菌的耐药性。
[0009] 本发明的第三目的在于提供一种检测鲍曼不动杆菌耐药性的方法，快速便捷，敏 感性好，特异性强，准确性高。
[0010] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0011] 一种检测鲍曼不动杆菌耐药性的引物，由上游引物P1和下游引物P2组成，所述上 游引物P1的碱基序列如SEQIDNo. 1所示；所述下游引物P2的碱基序列如SEQIDNo. 2 所示。
[0012] 鲍曼不动杆菌容易发生多重耐药或广泛耐药的重要原因在于这类细菌容易通过 基因水平转移获得外源的耐药元件。鲍曼不动杆菌具有几乎全套的自然转化系统，鲍曼不 动杆菌首先通过外膜蛋白识别外源DNA元件，在菌毛相关蛋白ComE、ComB、ComF和ComP的 介导下，通过PilU和PilT的摆动作用将外源DNA转运入细胞周质中；胞膜受体蛋白ComEA 与周质中外源DNA结合并将其传递给相应的核酸酶，核酸酶将双链DNA中的一条单链降解， 剩余的另一条互补单链则在内膜蛋白Pil〇、ComM以及PilN的共同作用下，通过膜通道蛋 白ComEC被转运到细胞内；进入胞内的单链DNA与DprA蛋白结合从而避免被胞内核酸酶降 解，并在RecA蛋白作用下与染色体基因进行同源重组，完成整个自然转化过程。
[0013] 经试验验证，ComM是否被插入直接决定鲍曼不动杆菌菌株是否具有天然感受态功 能。并且，鲍曼不动杆菌是否具有天然感受能力，很大程度是由ComM是否完整所决定的。
[0014] 经临床验证，鲍曼不动杆菌ComM若是被插入破坏，则鲍曼不动杆菌往往不具备天 然感受态能力，在其进化过程中不容易获得外源耐药元件，进而不容易获得多重耐药或广 泛耐药特性；右鲍曼不动杆囷ComM不被插入破坏，保持其完整性，该囷株往往具备完整的 天然感受态能力，在其进化过程中容易获得外源耐药元件，容易获得多重耐药或者广泛耐 药特性。
[0015] 本发明提供的上游引物P1和下游引物P2是根据鲍曼不动杆菌的ComM基因序列 进行设计的，以上游引物P1和下游引物P2作为引物，对ComM基因序列进行PCR扩增，具有 特异性强，敏感度高，重复性好等优点，能快速检测鲍曼不动杆菌的耐药性。
[0016] 本发明还提供了一种检测鲍曼不动杆菌耐药性的试剂盒，含有上述的上游引物P1 和下游引物P2。
[0017] 优选地，所述试剂盒还含有Taq酶、dNTPs和PCRbuffer。
[0018] 本发明还提供了一种检测鲍曼不动杆菌耐药性的方法，通过检测待测样本的ComM 基因的完整性来判断待测样本是否具有多重耐药或者广泛耐药特性。
[0019] 本发明提供的一种检测鲍曼不动杆菌耐药性的方法，基于ComM基因的完整性来 判断待测样本是否具有多重耐药与广泛耐药特性，ComM基因的碱基序列如SEQIDNo. 3所 示。若鲍曼不动杆菌ComM不完整，则鲍曼不动杆菌往往不具备多重耐药或者广泛耐药特 性；若鲍曼不动杆菌ComM完整，则判定鲍曼不动杆菌为多重耐药或者广泛耐药菌株。
[0020] 进一步地，检测待测样本的ComM基因的完整性通过分子水平进行检测。
[0021] 分子水平的检测包括一些常用的目的片段的扩增或是DNA分子杂交等，通过分子 水平来判断ComM基因的完整性。
[0022] PCR检测方便易行，快速便捷，检测特异性强，成本低，进一步地，所述分子水平检 测为PCR检测。
[0023] 进一步地，所述PCR检测所用的引物为上述的上游引物P1和下游引物P2。
[0024] 以上游引物P1和下游引物P2作为引物对待测样本进行PCR检测，敏感性好，特异 性强，准确性高。
[0025] 进一步地，所述PCR检测所用的退火温度为52°C±1°C。以该退火温度进行PCR 扩增，特异性好。
[0026] 优选地，PCR扩增程序为：
[0027] 94-95°Cl_3min;
[0028] 94-95Γ10-20s，52°C±1°C10-15s, 72°C30-40s，共 25-40 个循环；
[0029] 72Γ保持 3_5min。
[0030]进一步地，所述PCR检测所用的PCR体系的体积为15-50μ1。
[0031] 如，PCR体系的体积为50μ1，具体体系成分如下：
[0032] 待?则样本（Genomic DNA ) 1 μL 上游引物PI ( 1()μΜ ) ΙμL
[0033] 上游引物Ρ2 ( ΙΟμΜ ) ΙμL 2 χ Τ aq premix 25μ1 ddH2C) 22 μL 总体积 50 μ丨
[0034] 相应地，PCR体系的体积还可以为15μ1、20μ1、25μ1、30μ1等等，相应地，体系 内的各成分相应的缩小即可。
[0035] 进一步地，所述待测样本为鲍曼不动杆菌的基因组提取物。
[0036] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0037] (1)本发明是基于鲍曼不动杆菌ComM基因片段大小来检测鲍曼不动杆菌耐药性， 用于快速评估特定鲍曼不动杆菌是否具有多重耐药与广泛耐药特征，有效解决实验时长与 成品的问题，可以用于鲍曼不动杆菌耐药特性的快速评估。
[0038] (2)本发明还提供了测定ComM基因片段的引物，该引物特异性强，敏感度高，准确 性高，重复性好。
[0039] (3)本发明还提供了检测鲍曼不动杆菌耐药性的试剂盒，以便于检测鲍曼不动杆 菌的耐药性。
【附图说明】
[0040] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0041]图1为本发明实施例1中不同菌体的感受态细胞的摄入能力曲线图；
[0042]图2为本发明实施例2中不同菌体的感受态细胞的摄入能力曲线图；
[0043] 图3为本发明实施例3中不同菌体的基因组DNA进行PCR扩增的电泳图。
【具体实施方式】
[0044]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市售获得的常规产品。
[0045] 实施例1
[0046] ComM是否被插入直接决定鲍曼不动杆菌菌株是否具有天然感受态功能。
[0047] 鲍曼不动杆菌实验室标准菌株不具备形成天然感受态能力。本实施例使用放射性 同位素标记的DNA测试不同鲍曼不动杆菌菌株的DNA吸收能力，以评估其感受态形成能力。 所用的不同鲍曼不动杆菌菌株为AcinetobacterbaumanniiATCC17978,Acinetobacter baumanniiAYE和AcinetobacterbaumanniiA118。不同鲍曼不动杆菌菌株的感 受态细胞（l〇ml;l-3X109cells/ml)孵育30°C的矿质培养基中，该矿物培养基含有 a-35S-dATP-radiolabeledDNA40ng/ml，每次取出0. 5ml测样，检测细胞的放射性。结果如 图1所示。
[0048] 从图1可以看出，发现实验室标准菌株AcinetobacterbaumanniiATCC 17978和AcinetobacterbaumanniiAYE标准菌株并不具备形成天然感