一种柯萨奇病毒ca6型荧光定量pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及核酸荧光PCR检测试剂盒，尤其涉及萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检 测试剂盒，属于手足口病的体外诊断领域。
【背景技术】
[0002] 手足口病（hand,foot-mouthdisease)是世界范围内流行的儿童常见病，主要发 生于3岁以下儿童，但偶有成人发病的报告，是由多种肠道病毒引起的，以发热和手、足、口 腔等部位出现疱疹为主要特征的疾病，少数患病儿童可出现脑炎，急性弛缓性麻痹，心肌 炎，脑水肿等严重并发症，病情进展快，严重者可导致死亡。近些年来，手足口病在许多国 家，特别是亚太地区发生过多次的爆发或流行，越来越受到各国的关注。引起手足口病的病 原体多样，但都为单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科的肠道病毒。到目前为止，有文献 报道的20多个血清型可引起手足口病，主要有CA16、CA6、CA7、CA9、CA10、CB2、CB5、CB13、 ECH019以及EV71型等。最近，由于在世界范围的不同国家，CA6已经逐渐成为导致手足口 病的主要致病原，该病毒受到了越来越多的关注。
[0003] 在2013年夏天，中国长春市爆发了手足口病，总共有1125例病人确诊为手足 口病患者，大部分均为5岁以下，总共220份手足口病样本被收集并进行检测，有101份 (66. 9 % )为CA6 感染，其他感染的肠道病毒包括CA2 (1. 3 % )，CA10 (1. 9 % )，CA14 (0· 6 % )， CA16(5.9%)，CB4(1.3% )，EV71(19.2%)和EC30(0.6%)。在2012 年，该城市的EV71 阳 性率占检测样本的25. 5%，CA16则占到55. 5%，但是在2013年，长春市CA6已经取代EV71 和CVA16成为新的手足口病主要致病原。同样在2013年，中国的深圳也爆发了手足口病， 在201份肠道病毒阳性标本中，CA6感染率变成第一（47.8% )，其次是EV71 (18.9% )，再 次是CA16(i. 5% )。其他的肠道病毒也被检测到。在2013年，深圳市CA6取代TEV71成为 手足口病的主要致病原。
[0004] 柯萨奇病毒CA6型与其他柯萨奇病毒一样，属于小RNA病毒科，肠道病毒属 (Enterovirus)，致病谱广，是多种人类疾病的致病原。CA6病毒现在已经成为引起儿童 HFMD的主要病原之一。CA6病毒颗粒为二十面体对称球形，由核酸和蛋白质组成，无包膜和 突起。病毒颗粒核心含一开放阅读框架，编码的多聚蛋白经过自身蛋白酶水解，分为P1、P2 和P3三种前体蛋白。P1区前体蛋白又可编码病毒的结构蛋白P1~VP4,组成病毒衣壳。目 前常用的诊断方法为：病毒分离方法、血清学方法、PCR方法。
[0005] 其中，病毒分离方法利用组织培养、分离肠道病毒是目前诊断手足口病病原的金 标准，但是由于任何一种细胞都不可能对引起手足口病所有肠道病毒进行培养，所以，虽然 病毒培养技术是检测诊断肠道病毒的金标准，但此方法操作繁琐，分离率不高，在手足口病 的流行爆发期间，难以推广应用；血清学方法最常用的方法是酶联免疫吸附实验（ELISA)， 这种方法可以对单份血清或急性期和恢复期的双份血清进行检测，简单、快速，不需要特别 的仪器，非常适合基层医疗单位，但由于肠道病毒共同抗原表位的存在，所以均有不同程度 的交叉反应性；PCR(polymerasechainfaction，聚合酶链式反应），是一种分子生物学技 术，用于放大扩增特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制，即使采集的标本中含 有微量的病毒RNA或是失活病毒，也能经过PCR扩增后检测出来。与病毒分离以及血清学 检测相比，RT-PCR具有特异、简单、快速、敏感等优点，并且，扩增产物可以通过测序之后用 于分子流行病学分析。但是PCR也存在许多不足之处，PCR消耗试剂大、操作步骤多、容易 造成PCR污染，并且，PCR-次性检测的样本数有限，大规模检测时耗时耗力。
[0006]结合国内情况，在临床HFM诊断中，实时荧光PCR技术凭借着快速、敏感、特异等优 点显示出了其临床诊断的优越性，目前只有极少量荧光PCR诊断试剂盒在CA6诊断中使用， 缺乏完善的质控体系，操作比较繁琐，灵敏度不高，还需要进一步完善和提高技术水平，使 此类产品更加满足临床准确快速诊断的需要。
[0007] 临床上检测CA6-RNA的方法目前主要是基于实时荧光定量PCR的技术及其改进， 实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装 置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收 集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试 验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点（即Ct 值）以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考 品或标准品，则可以通过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值（即定 量检测）。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和 淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬 灭效应；如果扩增过程中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水 解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基 团发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增 而呈现线性增强。试验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴 阳性结果和样本浓度的定值结果，因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已 逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。
[0008] 国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术定量检测柯萨奇病毒CA6型的方法，这 些试剂盒所提供的CA6-RNA提取方法主要是酸-氯仿法和柱提取法，但是，有以下不足之 处：（1)酚-氯仿法虽然是最经典的RNA提取方法，但是操作繁琐，对于设备和人员操作要 求高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；柱提取方法虽然无需高速 离心，但是需频繁更换离心管，用时长，特异性较差；(2)无法有效去除样本中的PCR抑制 物；（3)没有设置阳性内对照（即内标），无法监控假阴性；(4) 一般没有预防PCR产物污染 的措施；（5)现有方法检测灵敏度欠佳，可能出现漏检现象。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于解决现有柯萨奇病毒CA6型核酸荧光定量PCR检测试剂盒的缺 陷，提供一种具有操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽而准确的柯萨奇病毒CA6 型核酸荧光定量PCR检测试剂盒，本试剂盒可以柯萨奇病毒CA6型RNA核酸片段进行快速 荧光PCR检测，并且可以对人血清或咽拭子或疱疹渗出液等标本中的柯萨奇病毒CA6型进 行定量分析，检测结果可用于柯萨奇病毒CA10型感染的辅助诊断和疾病监控。
[0010] 本发明实施例中提供了一种柯萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检测试剂盒，其包括 以下各组分：RNA提取溶液、RNA洗脱液、RT-PCR增强剂、内标、PCR反应液、CA6阳性对照品、CA6阴性对照品，其中，所述PCR反应液包括0· 2μmol/L~0· 4μmol/L用于靶多核苷酸扩 增的上游引物以及下游引物，0·2μπι〇1/1~0·4μπι〇1/1用于靶多核苷酸检测的探针，所述 用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针，其碱基对序列分别为：
[0011] 上游引物：5' -CTGCAGAAACGGGAGCAAG-3' ；
[0012] 下游引物：5'-GAGTAAAAGTGTTCCACACTCGC-3' ；
[0013] 探针 1 :5'FAM-ACCCCGTTTCGATTCATCACACA-BHQ13'。
[0014] 优选的，上述检测试剂盒，其中，所述内标为插入PUC18T载体的长为128碱基对 的人工合成DNA序列的重组体，其浓度为1. 00E+04copies/ml~5. 00E+04copies/ml;所述 128碱基对的序列如下所示：
[0015] 5'-GTCCAGTACTTTCAAAGCTCGATCCCGGTAACTACCAAATCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACCG ATCGCCTCTTCCCAACCTGTACGTACGTACGTACGTCCAAAAGTTTCCACGTACGATCGATC-3' 。
[0016] 优选的，上述检测试剂盒，其中，所述RNA提取溶液包括如下组分：
[0017] RNA提取溶液I:十二烷基硫