具有经修饰的糖基化的西妥昔单抗及其用图
【专利说明】具有经修饰的糖基化的西妥昔单抗及其用途
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2013年2月13日提交的美国临时申请系列号61/764,446的在35 U.S.C. § 119(e)下的权益，该临时申请标题为"CetuximabwithModifiedGlycosylation andUsesThereof"，其全部公开通过提述并入本文。 发明领域
[0003] 本发明部分涉及具有改变的糖基化模式的抗体，其生产方法，以及使用方法。
[0004] 发明背景
[0005]Erbitux(爱必妥）：_ (西妥昔单抗（cetuximab))是一种结合人上皮生长因 子（EGFR)的胞外域的重组嵌合单克隆抗体，并在临床上用于治疗特定形式的癌症。不幸 的是，当使用:Erbitux獻治疗时，一些患者已经经历变应性反应，在某些情况下为过敏性休 克和死亡。已显示了该变应性反应由识别存在于西妥昔单抗的商业形式Erbitux⑧上的 gal-α-1，3-gal糖基化分子的IgE所致（C.Chung,etal.Cetuximab-inducedanaphylaxis andIgEspecificforgalactose-alpha-1, 3-galactose.NEnglJMed(2008)； 358:1109-17)。gal-a-1，3-gal的添加认为是用于商业生产ErbiOlX砂的哺乳动物（鼠 骨髓瘤）细胞培养系统的结果。在中国仓鼠卵巢细胞中生产蛋白也可以导致蛋白上的gal-α-I, 3-gal部分（moieties)(Bosquesetal·，Nat.Biotechn. 28:1153-1156, 2010)。
[0006] 发明概述
[0007] 已发现在哺乳动物乳腺上皮细胞中产生的抗体（如经工程化而在其乳中分泌抗 体的转基因动物的哺乳动物乳腺上皮细胞）没有可检测的半乳糖-α-1，3-半乳糖部分。因 而，一方面，本公开提供没有可检测的半乳糖-α-1，3-半乳糖部分的抗体及其组合物。还 提供生产此类抗体的方法以及其使用方法。
[0008] 在一个方面，本公开提供糖基化抗体，其包含
[0009] (a)包含SEQIDNO: 1 的重链；
[0010] (b)包含SEQIDN0:2 的轻链；
[0011] 其中所述糖基化抗体比非乳腺细胞培养产生的糖基化抗体具有更少的半乳 糖-α-1，3-半乳糖部分。
[0012] 在本文提供的糖基化抗体的一些实施方案中，所述非乳腺细胞培养物是小鼠 骨髓瘤细胞培养物。在本文提供的糖基化抗体的一些实施方案中，所述更少的半乳 糖-α-1，3-半乳糖部分位于重链的可变区中。在本文提供的糖基化抗体的一些实施方案 中，所述更少的半乳糖-α-1，3-半乳糖部分位于如SEQIDNO: 1所示的重链的107位置 中。在本文提供的糖基化抗体的一些实施方案中，所述糖基化抗体缺乏半乳糖-α-1，3-半 乳糖部分。在本文提供的糖基化抗体的一些实施方案中，所述糖基化抗体在乳腺上皮细胞 中产生。在本文提供的糖基化抗体的一些实施方案中，所述糖基化抗体在非人转基因哺乳 动物的乳腺上皮细胞中产生。在本文提供的糖基化抗体的一些实施方案中，所述非人哺 乳动物是山羊、绵羊、野牛（bison)、骆驼、母牛（cow)、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠或羊驼 (llama)。在一些实施方案中，所述非人哺乳动物是山羊。在本文提供的糖基化抗体的一些 实施方案中，所述抗体是嵌合的，人源化的，或完全人的抗体。在本文提供的糖基化抗体的 一些实施方案中，所述抗体是西妥昔单抗。
[0013] 在一个方面，本公开提供组合物，其包括本文提供的任何糖基化抗体，以及药学上 可接受的载体。
[0014] 在一个方面，本公开提供包括糖基化抗体群体的组合物，其中所述糖基化抗体包 含：
[0015] (a)包含SEQIDNO: 1 的重链；
[0016] (b)包含SEQIDN0:2 的轻链；且
[0017] 其中所述抗体比非乳腺细胞培养产生的糖基化抗体具有更少的半乳 糖-α-1，3_半乳糖部分。
[0018] 在本发明提供的组合物的一些实施方案中，所述非乳腺细胞培养物是小鼠骨髓 瘤细胞培养物。在本文提供的组合物的一些实施方案中，所述更少的半乳糖-α-1，3-半 乳糖部分位于重链的可变区中。在本文提供的组合物的一些实施方案中，所述更少的半乳 糖-α-1，3-半乳糖部分位于如SEQIDNO: 1所示的重链的107位置处。在本文提供的组合 物的一些实施方案中，糖基化抗体缺乏半乳糖-α-1，3-半乳糖部分。在本文提供的组合物 的一些实施方案中，所述糖基化抗体群体在乳腺上皮细胞中产生。在本文提供的组合物的 一些实施方案中，所述糖基化抗体群体在非人转基因哺乳动物的乳腺上皮细胞中产生。在 一些实施方案中，所述非人哺乳动物是山羊、绵羊、野牛、骆驼、母牛、猪、兔、水牛、马、大鼠、 小鼠或羊驼。
[0019] 在一些实施方案中，所述非人哺乳动物是山羊。
[0020] 在本文提供的组合物的一些实施方案中，所述群体中的糖基化抗体是嵌合的，人 源化的，或完全人的抗体。在本文提供的组合物的一些实施方案中，所述群体中的糖基化抗 体是西妥昔单抗抗体。在本文提供的组合物的一些实施方案中，所述组合物进一步包括乳 (milk)。在本文提供的组合物的一些实施方案中，所述组合物进一步包括药学上可接受的 载体。
[0021] 在一个方面，本公开提供包括单克隆抗体的组合物，其中所述单克隆抗体包含：
[0022] (a)包含SEQIDNO: 1 的重链；
[0023] (b)包含SEQIDN0:2 的轻链；且
[0024] 其中所述组合物在转基因山羊的乳腺中产生。
[0025] 在一个方面，本公开提供包括单克隆抗体的组合物，其中所述单克隆抗体包含：
[0026] (a)包含SEQIDNO: 1 的重链；
[0027] (b)包含SEQIDN0:2 的轻链；且
[0028] 其中所述单克隆抗体缺乏半乳糖-α-1，3-半乳糖。
[0029] 在一个方面，本公开提供方法，其包括在乳腺上皮细胞中产生糖基化抗体群体， 使得产生的糖基化抗体群体比非乳腺细胞培养产生的糖基化抗体群体具有更少的半乳 糖-α-1,3-半乳糖部分，并且其中所述糖基化抗体含有包含SEQIDNO: 1的重链和包含 SEQIDN0:2 的轻链。
[0030] 在本文提供的方法的一些实施方案中，所述非乳腺细胞细胞培养物是小鼠骨 髓瘤细胞培养物。在本文提供的方法的一些实施方案中，糖基化抗体群体缺乏半乳 糖-α-1，3-半乳糖部分。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括收集 糖基化抗体群体。在本文提供的方法的一些实施方案中，在体外发生产生。在本文提供的 方法的一些实施方案中，在体内发生产生。在本文提供的方法的一些实施方案中，在非人转 基因哺乳动物中发生产生。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述非人哺乳动物是山 羊、绵羊、野牛、骆驼、母牛、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠或羊驼。在一些实施方案中，所述非 人哺乳动物是山羊。
[0031] 在本文提供的方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括纯化糖基化抗体群 体。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述方法包括比较所述糖基化抗体群体中存在 的半乳糖-α-1，3-半乳糖部分的数量与在非乳腺细胞培养物中产生的糖基化抗体群体中 存在的半乳糖-α-1，3-半乳糖部分的数量。
[0032] 在一个方面，本公开提供通过本文提供的任意方法产生的糖基化抗体群体。
[0033] 在一个方面，本公开提供乳腺上皮细胞，其产生本文提供的任意抗体。在本文提供 的乳腺上皮细胞的一些实施方案中，所述乳腺上皮细胞含有包含SEQIDΝ0:3的核酸和包 含SEQIDN0:4的核酸。在本文提供的乳腺上皮细胞的一些实施方案中，包含SEQIDN0:3 的核酸和包含SEQIDNO:4的核酸相连。
[0034] 在一个方面，本公开提供转基因非人哺乳动物，其包括本文公开的任意乳腺上皮 细胞。在一些实施方案中，所述非人哺乳动物是山羊。
[0035] 在一个方面，本公开提供乳腺上皮细胞，其产生本文公开的任意抗体群体。在一些 本文提供的乳腺上皮细胞的实施方案中，所述乳腺上皮细胞含有包含SEQIDN0:3的核酸 和包含SEQIDN0:4的核酸。在本文提供的乳腺上皮细胞的一些实施方案中，包含SEQID N0:3的核酸和包含SEQIDN0:4的核酸相连。
[0036] 在一个方面，本公开提供转基因非人哺乳动物，其包括本文公开的任意乳腺上皮 细胞。
[0037] 在一个方面，本公开提供方法，其包括将有效量的本文提供的任意抗体施用到有 所需要的受试者。
[0038] 在一个方面，本文提供方法，其包括将有效量的本文提供的任意组合物施用到有 所需要的受试者。
[0039] 在一些实施方案中，所述受试者患有癌症。在一些实施方案中，所述癌症是头 和颈癌或结肠直肠癌。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括施用 至少一种另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂是伊立替康 (irinotecan)、亚叶酸|丐（leucovorincalcium)、氣脈啼啶（fluorouracil)或其组合。
[0040] 附图简述
[0041] 首先描述附图。应当理解附图为示例性的而对于实现本发明是不需要的。
[0042] 图1示出了西妥昔单抗的重链（HC)的氨基酸序列（SEQIDNO: 1)。
[0043] 图2示出了西妥昔单抗的轻链（LC)的氨基酸序列（SEQIDNO:2)。
[0044] 图3示出了西妥昔单抗的重链（HC)的核酸序列（SEQIDNO:3)。
[0045] 图4示出了西妥昔单抗的轻链（LC)的核酸序列（SEQIDNO:4)。
[0046] 图5示出了质粒BC2552LC西妥昔单抗（轻链）（A)和该质粒的核酸序列（SEQID NO:5)⑶。
[0047] 图6示出了质粒BC2554HC西妥昔单抗（重链）（A)和该质粒的核酸序列（SEQID NO:6)⑶。
[0048] 图7示出了携带重链的质粒BC2584嘌呤霉素β酪蛋白载体（A)和该质粒的核 酸序列（SEQIDN0:7)⑶。
[0049] 图8示出了具有两种小鼠品系（#15和#27)的乳中的西妥昔单抗的表达水平的 Western印迹。
[0050]图9示出了用于检测乳产生的西妥昔单抗和商业产生的西妥昔单抗（Erbitux?) 中α-1，3-gal水平的Western印迹。
[0051] 图10示出了山羊#1和#2的乳中产生的西妥昔单抗的Western印迹。
[0052] 图11示出了山羊乳中产生的西妥昔单抗的纯化。
[0053]图12是描述对山羊中产生的西妥昔单抗（第2道，山羊#1和第3道，山羊#2)，以 及商业产生的ErbitUX?'的抗α1，3半乳糖单克隆抗体染色的Western印迹。
[0054] 图13是纯化的山羊#1的乳中产生的纯化的西妥昔单抗，以及山羊#2 的乳中产生的纯化的西妥昔单抗的质谱（LS/MS)。
[0055] 发明详述
[0056]Erbitux?(西妥昔单抗）是一种结合人上皮生长因子受体（EGFR)的胞外 域的人/小鼠嵌合重组抗体，并在临床上用来治疗癌症。对Erbitux?:结构的研究表 明在重链的框架区3上存在的一个N-连接糖基化位点被ga1 -a-1，3-ga1 (本文中也 称为"gal-a-l，3_gal" 或"a-l，3_gal"）占据，见JunQian，etal.:Structural characterizationofN-linkedoligosaccharidesonmonoclonalantibodycetuximab bythecombinationoforthogonalmatrix-assistedlaserdesorption/ionization hybridquadrupole-quadrupoletime-〇f-flighttandemmassspectrometryand sequentialenzymaticdigestion(AnalyticalBiochemistry364 (2007) 8 - 18) 〇 这一 gal-α-1，3-gal的存在认为是由于商业的ErbitUX?在小鼠骨髓瘤细胞中产生的事实所 致，已知所述小鼠骨髓细胞在N-连接糖基化位点