蛋白质的制造方法

文档序号:9602107阅读:1275来源:国知局
蛋白质的制造方法
【专利说明】蛋白质的制造方法 【技术领域】
[0001 ] 本申请涉及用于使重组细胞中的自外来性基因的蛋白质的表达亢进的重组细胞、 以及涉及利用那样的细胞的发明。更具体涉及,利用使P180蛋白质的表达、及/或SF3b4 蛋白质的表达均亢进的细胞、或者有这样的特征的细胞,使作为目的物的蛋白质的合成能 力或分泌能力亢进,作为结果提供制造蛋白质的方法。利用有上述特征的细胞,使作为目的 物的蛋白质的合成能力或分泌能力亢进,在作为其结果制造蛋白质的方法中,在用于作为 目的物的蛋白质表达的载体中利用顺式-元件也作为另外的特征。 【【背景技术】】
[0002] 应用基因重组技术的生物技术药品,近年、特别在抗体药品市场急速扩大,向其医 疗费的负荷也变得危险,常常要求可相比以往更有效进行蛋白质生产,成本更低的生物技 术药品的制造技术的开发。
[0003] 作为用于利用基因重组技术的蛋白质生产的宿主,至今利用,动物细胞、酵母、大 肠杆菌等。大肠杆菌等可以低成本生产作为目的物的蛋白质,但无法进行糖链修饰等的翻 译后修饰,在糖蛋白质的生产不适宜。另外,大肠杆菌有易制作含生产的蛋白质的包含体的 性质,在作为目的物的蛋白质的取得中,合成后,进一步增溶过程变得必要,存在作业负荷 尚的缺点。
[0004] 特别是,抗体等的糖蛋白质的情况中,附加的糖链由于对作为目的物的蛋白质的 水溶性、对蛋白酶的抵抗性、组织目标性、还有其生物活性也有影响,必要使用作为高等真 核生物的动物细胞的生产技术,近年其技术大大进步。那样的状况的原来、现在的抗体药品 的多数在中国仓鼠卵巢(CH0)细胞中生产,但其制造过程的优化依然是重要的课题。
[0005] 从含哺乳动物细胞的真核生物细胞向细胞外分泌的蛋白质在作为被内膜隔开的 细胞器的小胞体中合成。小胞体被大分为在表面具有由RNA-蛋白质的巨大复合物组成的 蛋白质合成装置的核糖体的粗面小胞体和无核糖体的滑面小胞体的2种,但不知粗面小胞 体的详细的形成结构。
[0006] 在活体内,存在专门从事特定的蛋白质的分泌的专门分泌细胞(professiona1 secretorycells),在它们的细胞中粗面小胞体显著地发达,被认为可进行高效率的蛋白 质生产。例如分泌胶原的成纤维细胞、分泌消化酶组的胰腺线房外分泌细胞等对应于那样 的专门分泌细胞。与这些的专门分泌细胞比较,多用于现在基因工程学蛋白质生产的CH0 细胞、HEK293细胞等有粗面小胞体非常地少量,分泌活性低的问题。
[0007] 在利用基因重组技术生产生物技术药品时,作为目的物的蛋白质的基因在表达载 体中显示高的转录活性的启动子的控制化,预计其mRNA以高水平表达。但是,即使置于那 样的状况下,也屡屡发生mRNA水平和蛋白质表达量本身不相关的情况,作为其一原因可举 在小胞体膜上的翻译效率的低。
[0008] 即认为,在多用于现在这些的基因工程学蛋白质生产的细胞中,只要可对于在小 胞体膜上的翻译装置易利用的形式提供mRNA,就与成纤维细胞的情况同样地,留有可越发 增强蛋白质合成能力的余地。
[0009] 在恒定分泌胶原的成纤维细胞中,编码胶原蛋白质的mRNA时常高水平表达,其大 部分在分泌蛋白质的生物合成的场所的小胞体膜上被检测(非专利文献1)。但是,为了使 胶原合成活化,仅在小胞体上存在其mRNA是不充分的,使翻译效率高的多核糖体形成变得 必要。
[0010] 由发明人的至今的解析知,在胶原基因等的一部分的蛋白质的mRNA中,具备易形 成附着多个作为蛋白质合成装置的核糖体的多核糖体的性质(专利文献1、非专利文献2)。 从这些推测可能是,在利用基因重组技术生产生物技术药品时,无关于编码目的蛋白质的 基因转录产物高水平表达,发生其蛋白质合成/分泌量低的问题是在利用的细胞中mRNA无 法以易在小胞体膜上的翻译装置中利用的形式提供。
[0011] 【现有技术文献】
[0012] 【非专利文献】
[0013] 非专利文献l:Ueno,T.,etal.,(2010).JBiolChem285(39),29941-50。
[0014] 非专利文献 2:Ueno,T.,etal.,(2012) ·Regulationofpolysomeassemblyon theendoplasmicreticulumbyacoiled-coilprotein,pl80.NucleicAcidsRes。
[0015] 【专利文献】
[0016] 专利文献 1:特愿 2011-227462 【
【发明内容】

[0017]【发明要解决的技术课题】
[0018] 小胞体中的蛋白质合成中,向小胞体的mRNA的定位(多核糖体形成)是必须的。 为了再高效率的蛋白质合成,多数的核糖体附着于mRNA的多核糖体形成的促进被认为是 非常地有效的,但不知P180蛋白质的多核糖体形成的促进功能的结构。
[0019] 【解决课题的技术方案】
[0020] 本申请的发明人进行详细的解析的结果新发现,与作为pl80蛋白质的多核糖体 形成促进功能的责任区域的卷曲螺旋结构域(非专利文献2)特异性地相互作用,促进mRNA 的小胞体(ER)定位的蛋白质、剪接因子3B亚基4(SF3b4)蛋白质。然后,在制出高表达 SF3b4蛋白质和pl80蛋白质的两方的细胞时,在有这样的特征的细胞中,mRNA的向小胞体 上的定位显著地升高,知可使培养细胞的分泌功能升高变得可能。结果,完成本申请发明。
[0021] 本发明的发明人显示可提供,在细胞中,促进pl80蛋白质的全长或其部分的表 达、然后mRNA的小胞体(ER)定位的蛋白质的表达亢进,在细胞内的作为目的物的蛋白质的 合成能力或分泌能力亢进的重组细胞。
[0022] 本发明的发明人另外显示,可在本发明的第2实施方式中,使pl80蛋白质的全长 或其部分的表达亢进,然后在使促进mRNA的小胞体(ER)定位的蛋白质的表达亢进的重组 细胞中,通过转化编码作为目的物的蛋白质的核酸分子或使作为目的物的蛋白质的产生量 增加,可使作为目的物的蛋白质的合成能力或分泌能力亢进,作为结果提供制造蛋白质的 方法。
[0023] 在本发明中提供这样的特征性的重组细胞,或者利用那样的特征性的重组细胞, 显示通过使作为目的物的蛋白质的合成能力或分泌能力亢进,可解决上述的课题。
[0024] [1]在细胞中,促进pl80蛋白质的全长或其部分的表达、mRNA的小胞体(ER)定位 的蛋白质的表达、或者这两方的表达均亢进,在细胞内的作为目的物的蛋白质的合成能力 或分泌能力亢进的重组细胞。
[0025] [2] [1]所述的重组细胞,其中pl80蛋白质选自:
[0026] (a)由与人来源的pl80蛋白质的氨基酸序列(SEQIDN0:2)有至少70%的序列相 同性的氨基酸序列组成,有促进细胞内的在小胞体膜上的多核糖体形成的功能的蛋白质、
[0027] (b)由在人来源的pl80蛋白质的氨基酸序列(SEQIDN0:2)中缺失、取代、或者附 加1个或数个氨基酸的氨基酸序列组成,有促进细胞内的在小胞体膜上的多核糖体形成的 功能的蛋白质、
[0028] (c)由与编码人来源的pl80蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDNO: 1)有至少 70%的序列相同性的核苷酸序列所规定的氨基酸序列组成,有促进细胞内的在小胞体膜上 的多核糖体形成的功能的蛋白质、
[0029] ⑷由在编码人来源的pl80蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDNO: 1)中缺失、 取代、或者附加1个或数个核苷酸的核苷酸序列所规定的氨基酸序列组成,有促进细胞内 的在小胞体膜上的多核糖体形成的功能的蛋白质、及
[0030] (e)由可和与编码人来源的P180蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDNO: 1)互补 的核苷酸序列在严格的条件下杂交的核苷酸序列所规定的氨基酸序列组成,有促进细胞内 的在小胞体膜上的多核糖体形成的功能的蛋白质。
[0031] [3] [1]或[2]所述的重组细胞,其中pl80蛋白质是哺乳动物来源的。
[0032] [4] [3]所述的重组细胞,其中哺乳动物的pl80蛋白质的全长或其部分是人 P180 蛋白质(SEQIDN0:2)、小鼠pl80 蛋白质(GenBank登录号No.NP_077243)、大鼠 P180蛋白质(GenBank登录号No.XP_230637)、中国仓鼠pl80蛋白质(GenBank登录号 No.XM_003496471)、狗pl80 蛋白质(GenBank登录号No.NP_001003179)、马pl80 蛋白质 (GenBank登录号No.XP_001915027)、猴pl80 蛋白质(GenBank登录号No.XP_002798281)、 黑猩猩pl80蛋白质(GenBank登录号No.XP_514527)、猪pl80蛋白质(GenBank登录号 No.XP_001926148)、或者它们的部分。
[0033] [5] [1]~[4]之任一项所述的重组细胞,其中pl80蛋白质的部分选自,含对应于 由有SEQIDN0:2所示的氨基酸序列的蛋白质(人pl80蛋白质)的第27~157氨基酸组 成的区域的氨基酸序列的部分、含对应于由第623~737氨基酸组成的区域的氨基酸序列 的部分、含对应于由第738~944氨基酸组成的区域的氨基酸序列的部分、含对应于由第 945~1540氨基酸组成的区域的氨基酸序列的部分。
[0034] [6] [1]~[5]之任一项所述的重组细胞,其中促进mRNA的小胞体(ER)定位的蛋 白质,自剪接因子3B亚基4(SF3b4)蛋白质的全长或其部分(SEQIDN0:4的全长氨基酸序 列 424AA;作为RRM1 的SEQIDN0:4 的 13 ~91AA;作为.RRM2 的SEQIDN0:4 的 100,。
[0035] [7] [6]之任一项所述的重组细胞,其中SF3b4蛋白质选自
[0036] ⑴由与人来源的SF3b4蛋白质的氨基酸序列(SEQIDN0:4)有至少70%的序列 相同性的氨基酸序列组成,有促进mRNA的向小胞体的定位的功能的蛋白质、
[0037] (ii)由在人来源的SF3b4蛋白质的氨基酸序列(SEQIDN0:4)中缺失、取代、或 者附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列组成,有促进mRNA的向小胞体的定位的功能的蛋白 质、
[0038] (iii)由与编码人来源的SF3b4蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDN0:3)有至 少70%的序列相同性的核苷酸序列所规定的氨基酸序列组成,有促进mRNA的向小胞体的 定位的功能的蛋白质、
[0039] (iv)由在编码人来源的SF3b4蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDN0:3)中缺 失、取代、或者附加1个或数个核苷酸的核苷酸序列所规定的氨基酸序列组成,有促进mRNA 的向小胞体的定位的功能的蛋白质、
[0040] (V)由可和与编码人来源的SF3b4蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDN0:3)互 补的核苷酸序列在严格的条件下杂交的核苷酸序列所规定的氨基酸序列组成,有促进mRNA 的向小胞体的定位的功能的蛋白质。
[0041] [8] [6]或[7]所述的重组细胞,其中SF3b4蛋白质是哺乳动物来源的。
[0042] [9] [8]所述的重组细胞,其中哺乳动物的SF3b4蛋白质的全长或其部分是人 SF3b4 蛋白质(SEQIDN0:4)、小鼠SF3b4 蛋白质(GenBank登录号No.NP_694693. 1)、大 鼠SF3b4 蛋白质(GenBank登录号No.ΝΡ_001011951· 1)、中国仓鼠SF3b4 蛋白质(GenBank 登录号No.ΧΡ_003498680· 1)、狗SF3b4 蛋白质(GenBank登录号No.ΧΡ_540295· 3)、马 SF3b4 蛋白质(GenBank登录号No.ΧΡ_001488649. 2)、猴SF3b4 蛋白质(GenBank登录号 No.NP_001097793. 1)、黑猩猩SF3b4 蛋白质(GenBank登录号No.XP_513768. 2)、猪SF3b4 蛋 白质(GenBank登录号No.ΧΡ_001926524. 1)、或者它们的部分。
[0043] [10] [1]~[9]之任一项所述的重组细胞,其中作为目的物的蛋白质的合成能力 或分泌能力通过转化编码作为目的物的蛋白质的核酸分子或使作为目的物的蛋白质的产 生量增加亢进。
[0044] [11]细胞株,其由保藏号NITEBP-01753(CH0 3D5)、保藏号NITEBP-01535(CH0 YA7)、或者保藏号NITEABP-01811(CH01B2)表示。
[0045] [12]制造作为目的物的蛋白质的方法,其使pl80蛋白质的全长或其部分的表达 充进,使促进mRNA的小胞体(ER)定位的蛋白质的表达充进,或在使这些蛋白质两方的表达 亢进的重组细胞中,通过转化编码作为目的物的蛋白质的核酸分子或使作为目的物的蛋白 质的产生量增加。
[0046] [13] [12]所述的方法,其中pl80蛋白质是哺乳动物来源的。
[0047] [14] [13]所述的方法,其中哺乳动物的pl80蛋白质的全长或其部分是人 P180 蛋白质(SEQIDN0:2)、小鼠pl80 蛋白质(GenBank登录号No.NP_077243)、大鼠 P180蛋白质(GenBank登录号No.XP_230637)、中国仓鼠pl80蛋白质(GenBank登录号 No.XM_003496471)、狗pl80 蛋白质(GenBank登录号No.NP_001003179)、马pl80 蛋白质 (GenBank登录号No.XP_001915027)、猴pl80 蛋白质(GenBank登录号No.XP_002798281)、 黑猩猩pl80蛋白质(GenBank登录号No.XP_514527)、猪pl80蛋白质(GenBank登录号 No.XP_001926148)、或者它们的部分。
[0048][15] [13]或[14]所述的方法,其中哺乳动物的pl80蛋白质的部分选自,含由有 SEQIDN0:2所示的氨基酸序列的蛋白质(人pl80蛋白质)的第27~157氨基酸组成的 区域的部分、含由第623~737氨基酸组成的区域的部分、含由第738~944氨基酸组成的 区域的部分、含由第945~1540氨基酸组成的区域的部分。
[0049] [16] [12]~[15]之任一项所述的方法,其中促进mRNA的小胞体(ER)定位的蛋 白质汾,选自剪接因子3B亚基4 (SF3b4)蛋白质的全长或其部分(SEQIDN0:4的全长氨基 酸序列 424AA;作为RRM1 的SEQIDN0:4 的 13 ~91AA;作为·RRM2 的SEQIDN0:4 的 100〇
[0050] [17] [16]所述的方法,其中SF3b4蛋白质是哺乳动物来源的。
[0051] [18] [17]所述的方法,其中哺乳动物的SF3b4蛋白质的全长或其部分是人SF3b4 蛋白质(SEQIDN0:4)、小鼠SF3b4 蛋白质(GenBank登录号No.NP_694693. 1)、大鼠 SF3b4 蛋白质(GenBank登录号No.ΝΡ_001011951· 1)、中国仓鼠SF3b4 蛋白质(GenBank 登录号No.ΧΡ_003498680· 1)、狗SF3b4 蛋白质(GenBank登录号No.ΧΡ_540295· 3)、马 SF3b4 蛋白质(GenBank登录号No.ΧΡ_001488649. 2)、猴SF3b4 蛋白质(GenBank登录号 No.NP_001097793. 1)、黑猩猩SF3b4 蛋白质(GenBank登录号No.XP_513768. 2)、猪SF3b4 蛋 白质(GenBank登录号No.XP_001926524. 1)、或者它们的部分。
[0052] [19] [12]~[18]之任一项所述的方法,其中重组细胞是由保藏号NITE BP-01753 (CH0 3D5)、保藏号NITEBP-01535 (CH0YA7)、或者保藏号NITEABP-01811(CH0 1B2)表示的细胞株。
[0053] [20] [12]~[19]之任一项所述的方法,其中作为目的物的蛋白质是糖蛋白质。
[0054] [21] [20]所述的方法,其中作为目的物的蛋白质是胶原、纤连蛋白或抗体。
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