细胞内表型筛选的制作方法

细胞内表型筛选的制作方法
【专利说明】细胞内表型筛选
[0001] 本发明涉及用于鉴定涉及细胞表型的细胞靶标的方法，包括鉴定能修饰细胞表型 的胞内抗体和鉴定胞内抗体的直接或间接的细胞靶标。本发明还涉及能抑制由过敏性刺激 引发的肥大细胞上的脱颗粒反应的胞内抗体，尤其是涉及胞内抗体3H2-U3H2-VH和5H4， 并且具体涉及胞内抗体3H2-1和5H4,其能够直接或间接地分别靶向ABCF1家族的蛋白和 C120RF4家族的蛋白。本发明还涉及ABCF1和C120RF4抑制剂，其用于治疗中的用途，尤其 是用于治疗过敏和/或炎症状况。
[0002] 对与给定表型有关的细胞靶标的鉴定是更好地理解该表型潜在的细胞机制的基 本如提。具体而目，鉴定与医疗状况有关的细胞革G标是制药工业的巨大兴趣所在，因为其使 得能够设计新的治疗，所述治疗对这些靶标有效果，并能用于治疗或诊断医疗状况。细胞表 型可能经常与给定的病理学有关。因此，能够允许对修饰细胞表型的分子进行鉴定的测定 (表型筛选）能对药物设计有巨大帮助。对与给定表型有关的新细胞靶标的鉴定对其他行 业也是重要的，例如在化妆品中或在植物和食品工业中。
[0003] 理解已知或未知的细胞分子在给定表型中起的作用并不是件容易的事，这尤其是 因为细胞途径是高度复杂的并且因为许多细胞内分子在若干不同的细胞途径中起作用。因 此，使靶蛋白失活（例如通过RNA干扰）能对一些细胞途径具有调节作用并且因此产生一 些伴随的表型效应，所述表型效应可能彼此难以区分。此外，许多细胞蛋白能呈现不同的构 象和/或可以包含翻译后修饰如磷酸化的氨基酸，并且因此可以与或不与另一个分子相互 作用，作为它们的构象的功能或翻译后修饰的功能。因此，能够允许对那些造成给定表型的 细胞靶标进行筛选，并且甚至对呈特定构象和/或经修饰的或未经修饰的状态的靶标进行 筛选而不使这些细胞靶标完全失活的技术，对于更好地理解一些细胞途径是具有极高价值 的工具。
[0004] 抗体可被视为精密工具，因为它们对它们的靶标是高度特异性的，并且能针对蛋 白的几乎任何部分产生，并且尤其是针对较大的平面区域（蛋白相互作用常在此处发生， 并且其更难用小有机分子或肽靶向）产生。然而，天然抗体不适应于细胞内环境，因为它 们的尺寸大并且因为细胞质的还原环境阻止了二硫桥的形成，并因此阻止了抗体的适当折 叠。已经开发了重组抗体，其中包括scFv、双抗体和sdAb，用于细胞内环境中的表达。将它 们称为"细胞内抗体"或"胞内抗体"。
[0005] 发明人的团队近期所描述的一个应用，是将根据其对靶抗体（或"Ab"）的调节效 果预先选出的胞内抗体用于筛选小分子文库的用途（欧洲专利EP1743178B1)。其目的在于 分离出能模拟感兴趣的scFv的细胞内作用并且可以体内使用的候选药物。发明人将Ab的 这种ELISA置换应用在过敏模型中。同一团队此前的工作已分离出了针对酪氨酸激酶Syk 的SH2结构域的scFv，所述结构域与肥大细胞激活的早期阶段有关。已经显示，这种scFv在 肥大细胞系中的细胞内表达抑制了由IgE受体激活所诱导的过敏递质（mediator)的释放， 而不干扰Syk的激酶活性（Dauvillier等，2002)。开发出了Ab置换测定（Abdisplacement assay)来分离抗-SykscFv的分子模拟物。以这个方式，对3000种分子的化学文库进行筛 选，结果鉴定出了一种分子，指定为C-13。这种分子具有高抗过敏潜能，因为进一步的研究 证明了其在小鼠中体外抑制肥大细胞激活的能力以及体内抑制过敏性休克的能力（Mazuc等，2008)。通过结构分析和定向诱变还鉴定出了C-13与Syk相互作用的位点。在Syk的 两个SH2结构域之间的界面处鉴定出的腔（cavity)被用于对500000种分子的文库进行计 算机中的（insilico)第二次筛选。以这种方式，按照其抑制过敏递质释放的能力选出了 85种非酶的Syk抑制剂（Villoutreix等，2011)。
[0006]Inoue等（2011)描述了用随机化的细胞内骆驼科动物VHH文库进行的功能缺 失筛选。作者认为常规VH结构域在细胞内环境中是不可溶的。在相应的日本专利申请 JP2008-136455中，Inoue等的作者也认为scFvs在细胞内功能缺失筛选的背景下是无用 的，因为其细胞内稳定性和功能性低。
[0007] 发明人开发出了基于使用细胞内抗体（或"胞内抗体"）的新的表型筛选技术，用 于鉴定能对细胞途径起作用并调节感兴趣的表型的细胞靶标。本工作描述了首例用细胞内 人抗体片段在哺乳动物细胞中进行的表型选择。
[0008] 发明人开发出的新方法允许鉴定与给定表型有关的细胞内靶标，并且尤其是未知 的细胞内靶标或已知的此前未与给定表型联系在一起的靶标。发明人使用这项技术鉴定出 两种RBL-2H3细胞克隆，称为3H2和5H4,其分别表达抗体片段3H2-1和3H2-VH，以及5H4。 当在肥大细胞中表达时，这些抗体片段抑制脱颗粒反应，所述脱颗粒反应通常由过敏挑战 而引发。发明人还鉴定出了两种蛋白，ABCF1和L0C297607,它们分别能与3H2-1和5H4 - 起沉淀。发明人证明了L0C297607涉及肥大细胞脱颗粒，对于L0C297607现有技术中没有 记载已知的功能。
[0009] 用于在蛋白质组规模实现表型筛选的细胞内Ab的选择提供了诸多优势。确实，当 在细胞中表达时，它们能干扰蛋白功能并进而产生给定的表型。此外，伴随着它们的高亲和 性和特异性特性，它们潜在地能够靶向细胞中的任何分子，尤其是蛋白，以及更精确地说靶 向一些亚结构域或转录后修饰（其可能涉及具体的信号传导）。在疾病模型的背景下，细胞 内抗体提供的另一个优点是，当它们的靶标被鉴定出来时，它们便能用于指导药物开发。
[0010] 更具体而言，高多样性的且针对细胞内表达进行优化后的组合的（combinatory) scFv文库的使用，使发明人能进行大规模表型筛选。将这种筛选应用于肥大细胞激活的模 型，它们在这个信号传导途径中鉴定出了新的分子参与者（molecularplayer)。
[0011] 这个方法最初是用允许scFv文库在肥大细胞系中表达的质粒系统开发出来的。 为了尽可能保持文库的初始多样性，选出了施行多拷贝表达模式的转染条件。进行了表型 选择，其导致呈现感兴趣的表型且表达scFv的细胞富集，所述scFv抑制所研究的信号传导 途径。两种具体抗体（Ab)片段3H2-1和5H4在肥大细胞系RBL-2H3中的表达，强烈抑制了 细胞释放过敏递质的能力。在产生它们以后，将这些抗体体外使用，以通过免疫沉淀实验与 质谱法联用来鉴定它们的蛋白靶标。蛋白ABCF1和L0C297607从而分别被鉴定为3H2-1和 5H4的靶标。
[0012]L0C297607(或"L0C"）是此前功能未知的蛋白，其似乎涉及经过FcεRI的肥大细 胞激活。的确，用shRNA的实验的初步结果提示其干预对受体激活后的早期事件以及对过 敏递质释放的稍后事件的调控。在肥大细胞中通过评估干预由FcεRI介导的信号转导的 蛋白的活性等来更精确地鉴定蛋白L0C的分子配偶体（partner)会是有趣的。
[0013] 此外，一些基因组数据提示蛋白L0C和炎症之间的联系。一项用染色体定位作图 技术的研究通过在猪中的杂交辐射显示了LOC的染色体基因座可能与炎症有关，并且更具 体与特定形式的关节炎有关（Genini等，2006)。在Genebank中分析这个染色体基因座时， 发明人发现L0C基因与编码蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN6的基因共定位。此外，这种染色体共 定位在大鼠、小鼠和人之间是保守的。这个信息说明，这些蛋白可能涉及相同的信号传导网 络。的确，鉴定蛋白-蛋白相互作用的新方法是基于在不同物种间比较关联蛋白序列之间 的染色体距离（Pazos和Valencia，2001)。
[0014] 为了将这种表型筛选方法最大化并扩大其范围，发明人采用逆转录病毒系统对其 进行调整使之适应于scFv文库的细胞内表达。与此前的质粒系统相比，这种表达模式使得 能够对更广泛的全部细胞类型进行转染，并提供稳定表达，这使得能在更长的时期进行表 型研究。
[0015] 在质粒选择期间，每个细胞表达了 2000-2500个scFv的拷贝，这使得在处理相对 小数量的细胞时能对多样性广泛的scFv进行探索。然而，每个细胞表达如此多scFv的事 实，施予了它们每一个之间在细胞内作用方面的强烈竞争，并因此可能维持高背景噪声。就 这一点而言，每个细胞不超过3个拷贝的逆转录病毒文库表达，具有降低选择压力的优点。 这些条件也使筛选能在更为生理学的条件中进行，在所述生理学的条件中蛋白网络的完整 性不被过表达破坏。
[0016] 高通量测序分析揭示，在逆转录病毒选择期间的每两轮中包含再克隆步骤，使得 scFv更好地富集。来自同一个选择（selection)且经过独立分析的细胞克隆显示出对 β-己糖胺酶脱颗粒作用的显著抑制，这说明该选择有效地允许抑制性的scFv富集。
[0017] 最后，使得对三个选择能够互相进行比较的主要数据，是在细胞刺激后膜联蛋白V 标记的表型的演变（evolution)(图26)。发明人发现包括了逆转录病毒再克隆步骤的选 择使其朝着最明显的抑制性表型收敛，因为其几乎被被完全消除（92%抑制）。一个假说 是，在有再克隆的情况下，被选出的细胞群会在同时具有良好增殖和抑制性表型的克隆中 富集。这种假说能解释两个逆转录病毒选择之间在朝着抑制性表型的收敛上的差异。
[0018] 本发明已证明了基于scFv的文库能成功地用于表型的细胞内筛选。通过使用 scFvs的高多样性文库，基于具有细胞内稳定性的恒定框架，发明人成功发现并鉴定了针对 给定表型的未知的细胞内靶标，所述表型例如肥大细胞脱颗粒。
[0019] 发明人还发现，截短的scFv，包括胞内抗体3H2-VH、5H4-VH在细胞内环境中可以 是稳定且功能性的。具体而言，发现限定为完整VH结构域的胞内抗体5H4-VH在所述细胞 内环境中是稳定的，并且成功地抑制了肥大细胞脱颗粒。
[0020] 本发明第一个方面是用于鉴定涉及细胞表型的细胞靶标的方法，该方法包括：
[0021] a)鉴定胞内抗体，当其存在于细胞内时其能诱导、修饰或抑制所述表型；
[0022] b)鉴定细胞靶标，其是所述细胞中所述胞内抗体的直接或间接靶标；并任选地
[0023]c)分离所述细胞靶标。
[0024] 优选的胞内抗体包含免疫球蛋白的完整VH和/或Vj吉构域。
[0025] 抗体是识别蛋白，其能特异性地结合抗原上的独特表位。抗体的抗原结合位点称 为互补位。抗体属于免疫球蛋白（Ig)类的蛋白。免疫球蛋白是一种蛋白家族，该家族的蛋 白的共同之处在于都有特异性的结构域，称为"Ig_折叠"。最多的天然存在的抗体（或常 规抗体）是约150kDa的球蛋白，其包含两条轻链（L)和两条重链（H)通过二硫键连结在一 起。以没有轻链为特征的非常规的抗体在骆驼科动物（camelid)和非软骨鱼类（如鲨鱼） 中发现。轻链和重链包含恒定区（分别是Q和CH)和可变区（分别是\和￥》。在哺乳动 物中有5类Ig重链（α、δ、ε、γ、μ)，其长度为约450 - 550个氨基酸，以及2类Ig轻 链（κ、λ)，其长度为约210-220个氨基酸。Ig链由称为"Ig域"的结构域组成。α、δ和 γ重链由一个可变结构域、三个恒定结构域和一个增加柔性的铰链区组成。ε和μ重链 由一个可变结构域和四个恒定结构域组成。κ和λ轻链由一个可变结构域和一个恒定结 构域组成。Ig结构域通常具有约110个氨基酸。每个可变结构域包含高变区或环，其负责 表位结合，并被称为互补决定区（CDR)，而CDRs之间的低变区称为框架区。完整哺乳动物 VH和V#吉构域包含3个CDR，称为CDR1、CDR2、和CDR3，以及4个框架区，称为FR1、FR2、FR3 和FR4。相比之下，截短的VH和V#吉构域缺少⑶R中的至少一个或框架区中的至少一个， 例如通过在核苷酸序列内出现终止密码子而编码所述截短的VH和^结构域。类似地，截短 的scFv缺少VH和/或八结构域的CDR中的至少一个或框架区中的至少一个。截短的scFv 可能由单个的完整VH或八结构域组成。重链⑶R3是与抗原相互作用的主要贡献者。所有 Ig结构域都具有特有的紧凑球状结构，称为"Ig-折叠"。Ig-折叠的结构是技术人员所熟 知的。简言之，其由以希腊钥匙拓扑结构排成两个β-片层的7-9个反向平行β-链的两 层夹心组成。其主干在两个β-片层之间反复交替。典型地，其模式为（片层1中的Ν-末 端发夹）_(片层2中的β-发夹）-(片层1中的β-链）-(片层2中C-末端β-发 夹）。两个片层也是通过二硫桥互相连接的。⑶R区形成环，其被保持于夹心结构的外 部。
[0026]常规抗体由木瓜蛋白酶消化产生三个片段：两个Fab片段（抗原结合片段）和一 个Fc片段（可结晶片段）。Fab片段是一种结合到抗原的抗体区域。它约为50kDa且由每 条重链和轻链的一个恒定和一个可变结构域组成。两个可变结构域（VJPVH)塑造形成了 抗原结合位点（互补位）。Fc区是抗体的尾部区域，其与细胞表面受体（Fc受体）相互作 用。常规抗体由胃蛋白酶消化产生两个片段：F(ab'）2片段（抗原结合片段）和pFc'片段。 卩(&13'）2片段包含两个抗原结合位点并可通过温和的还原反应分裂为两个Fab'片段。重链 和轻链可变区可以融合到一起形成单链可变片段（scFv)，其保留了Fab片段的特异性而仅 有其一半的大小（约25kDa)。scFv的\和VH结构域通常通过约15个氨基酸的短肽接头 互相连接。所述接头通常富含甘氨酸以具有柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以具有溶解性。 能通过将两个或三个scFvs连接在一起从而设计出二价或三价的scFv。二价scFvs(双抗 体的一种形式）是为人所感兴趣的，因为它们对于它们的靶标具有非常高的亲和性。单结 构域抗体（sdAb)是约12-15kDa的抗体，其由单个可变结构域（VJ^VH结构域）组成。例 如，sdAbs能由骆驼科动物VHH结构域、由常规抗体的VH或八结构域、或由重组VH或Vj吉构 域组成。scFv、双抗体和sdAbs的一个优点是它们能被表达为单肽并能例如在细菌中产生 且在·菌体上展示。
[0027]根据本发明，K或"Ab"）是包含了免疫球蛋白的至少一个\或￥"结构域的 蛋白。
[0028]根据本发_，朐内抗体（或"细朐内抗体")是一种抗体，例如scFv、双抗体和sdAb， 其适合在细胞内环境中使用。具体而言，所述抗体能在细胞胞质溶胶和/或核的还原条件 中折叠，并且在细胞内环境中是稳定的。胞内抗体能具体包含完整VH结构域、完整V#吉构 域、或二者皆有。胞内抗体能具体是scFv、包含至少一个完整VH或I结构域的截短的scFv、 双抗体或是VH或八结构域。优选地，胞内抗体是scFv或包含至少一个完整VH或八结构域 的截短的scFv，最优选的是完整VH结构域。
[0029] 根据本发明并根据对术语的普遍理解（Muyldermans, 2001)，VHSV。结构域指的是 常规的VH或八结构域，即抗体的（而不是的骆驼科动物抗体的）VH或八结构域。就其他方 面而言，术语"VH结构域"不包括VHH片段，尤其是骆驼科动物VHH片段。因此，在本发明的一 个具体实施方案中，VH结构域和优选地结构域是非骆驼科动物抗体，或是来源于非骆驼 科动物抗体，优选为非骆驼科动物的哺乳动物抗体或是来源于非骆驼科动物的哺乳动物抗 体。在另一个实施方案中，VH和优选地V#吉构域不是非软骨鱼抗体或不是来源于非软骨鱼 抗体。
[0030] 常规VH或I结构域和骆驼科动物VHH之间的差异在许多序列和结构差异中找到 了基础（Muyldermans，2001)。例如，骆驼VHH的⑶R1和⑶R2环采取的结构超出了针对常 规抗体的VH或^结构域所描述的标准结构。此外，VH结构域在其FR2区中包含4个标准 的疏水氨基酸，其参与了与\结构域的界面。在VHH中这些氨基酸都是突变的。这些突变， Val37Phe(或Tyr)、Gly44Glu(或Gin)、Leu45Arg(或Cys)和Trp47Gly(或Ser、Leu，或Phe) (Kabat编号，参考Kabat等，1991，以及Kontermann和DUbel, 2010)在胳盤抗体内是高度 保守的并且是将它们与常规VH结构域区分开的关键特征。相比于常规抗体的CDR3环（对 于人抗体是12个氨基酸，对于小鼠抗体是9个氨基酸），VHH抗体的CDR3环也更长（16-18 个氨基酸，通常对于骆驼VHH是17个）。
[0031] 已确认VHHs具有结合凹陷式抗原位点的能力，这是归功于其较小的尺寸和其延 长的CDR3环穿入这些位点中的能力。然而，VHHs的单结构域性质对结合小抗原来说可能 是缺点，因为这些能结合到VH-\界面处的沟或腔中。
[0032] 在一个具体实施方案中，根据本发明的VH结构域包含如下氨基酸中一个或多个， 优选为全部：氨基酸V37、G44、L45和W47,参考Kabat编号方案。
[0033] 或者，根据本发明的VH结构域包含（优选为在FR2区中）基序VNNNNNNGLNW，其中 每个N是彼此独立地选出的氨基酸，优选为选自遗传密码的20种标准氨基酸。
[0034] 此外，或者可替代地，根据本发明的VH结构域也能包含（优选为在FR2区中）基序 VNNNNNNGLNW的变体，其中每个N是氨基酸，其彼此独立地选出，优选为选自遗传密码的20 种标准氨基酸，并且其中所述变体包含一个或多个，如1-2个或1-3个任何"N"氨基酸的氨 基酸添加，和/或一个或多个，如1-2个或1-3个任何"N"氨基酸的氨基酸缺失。
[0035] VH结构域和/或I结构域的⑶R3环优选地包含1-15个氨基酸，更优选为1-12个 氨基酸。
[0036] 不仅含有完整scFvs、还含有截短的scFvs的胞内抗体高多样性文库的使用，使得 能够企及高多样性的表位。虽然完整scFvs优选地与靶蛋白的表面或与小抗原相互作用， 但截短的scFvs，如sdAbs，因为它们的尺寸较小，更适合于与蛋白腔相互作用。因此完整 scFvs更适合于破坏蛋白-蛋白相互作用，而截短的scFvs，如sdAbs更适合于与其革巴抗原 上的小分子结合位点或酶位点相互作用。因此，在用于筛选未知靶标的文库中存在两种类 型的胞内抗体是高度有利的。
[0037] 在一个具体的实施方案中，胞内抗体包含来源于人抗体的\和/或VH结构域。更 优选地，胞内抗体是来源于人抗体的scFv、包含来源于人抗体的至少一个完整\或VH结构 域的截短的scFv、来源于人抗体的双抗体或来源于人抗体的^或VH结构域。更普遍而言， 胞内抗体可以来源于人抗体。
[0038] 如此处所意指的，"来源于人抗体的\或VH结构域"表示与人免疫球蛋白的\^或 VH结构域完全相同或基本完全相同的八或VH结构域。"基本完全相同"意指所述八或VH结 构域可具有人免疫球蛋白的\或VH结构域，其中将修饰引入了一个或多个CDR区，优选为 引入CDR3区。也可以将修饰引入框架区，只要它们对\或VH结构域的细胞内折叠和/或 细胞内稳定性没有不利影响的话。
[0039] 修饰能由一个或多个氨基酸的点突变、添加和/或缺失组成，例如1-20个氨基酸， 特别是1-15个氨基酸，更具体是1-12个氨基酸。当将修饰引入一个CDR区时，可以修饰 该CDR的一个至全部的氨基酸。优选地，引入修饰以具有与和经修饰的CDR或框架区相对 应的天然人CDRs或框架区中所观察到的相同的氨基酸表现。还引入修饰，以使"来源于人 抗体的\或VH结构域"在使用下文所述用于评估抗体来源物种的测试时仍然被识别为人 的。在其他方面，当"来源于人抗体的\或￥"结构域"的序列与多种物种（包括人类（homo sapiens))的免疫球蛋白或其片段的文库比对时，"最佳命中"对应于人免疫球蛋白或其片 段。
[0040] 如此处所意指，来源于人抗体的scFv包含来源于人抗体的\结构域和来源于人 抗体的VH结构域。类似地，来源于人抗体的双抗体包含两个来源于人抗体的sdAbs。
[0041] 若作适当变动（mutatismutandi)，术语"来源于特定物种或物种群体的抗体 的"（例如"来源非骆驼科动物抗体的"）应当以与"来源于人抗体的"相似的方式理解。
[0042] 在另一个实施方案中，胞内抗体包含人源化的\和/或VH结构域。更优选的是， 胞内抗体是人源化的scFv、包含至少一个完整人源化VJ^VH结构域的截短的scFv、人源化 的双抗体或人源