用于检测基因组拷贝数变化的系统和方法
【专利说明】用于检测基因组拷贝数变化的系统和方法
[0001] 本申请要求2013年3月15日提交的临时专利申请系列号61/787, 419的优先权， 其通过引用以其整体结合到本文中。 发明领域
[0002] 本发明涉及用于检测基因组拷贝数变化的系统和方法。具体而言，本发明涉及用 于检测拷贝数变化的下一代测序方法。
[0003] 背景 拷贝数改变（CNV)是大小范围为500个碱基以上（经常在五千和五百万个碱基之间） 的基因组区域的获得或丢失。全基因组研究已显示，在人类中存在大量的CNV区域，和在普 通人群之间存在广泛范围的遗传多样性。因为其在人类遗传病症中的作用，CNV已经成为 许多新近研究的焦点。参见例如Iafrate等，2004，NatGenet36: 949-951;Sebat等， 2004，Science305: 525-528;Redon等，2006，Nature444: 444-454;Wong等，2007， AmJHumGenet80: 91-104;Ropers, 2007,AmJHumGenet81: 199-207;Lupski, 2007，NatGenet39:S43-S47,上述各文献通过引用予以结合。非整倍性，例如三体性或 全染色体缺失，是与多种人类疾病相关的拷贝数改变的限制类型。
[0004] 比较基因组杂交（CGH)是一种用于检测拷贝数变化和其它基因组畸变的技术。在 CGH中，通常将试验样品与参考样品比较，以测定基因组畸变的存在。通常，将来自试验样品 的核酸与来自参考样品的核酸差异标记，并通常将来自两种样品的核酸杂交至探针的微阵 列。然后自杂交至微阵列的核酸检测信号。自试验和参考核酸的标记产生的信号的对数比 率（log比率）与期望值（例如，对于二倍体区域为〇)的偏差经检测和可用作拷贝数差异 的指示。
[0005] 目前可用的CGH技术仍具有明显的局限性。例如，通常称为〃GC波〃（其可由于用 于CGH的探针的鸟嘌呤/胞嘧啶（GC)含量所致）的某些泛基因组的人工产物可引起对数 比率偏离其期望值，产生假阳性。GC-波可加入大范围的变异性至探针信号比率，并干扰数 据分析算法，这是因为它们可使信号对数比率数据偏斜远离期望值。GC-波人工产物可增 加在特定的基因组区域中的假阳性畸变调用的可能性，并还可遮掩真实的畸变调用（参见 Marioni等，（2007)，GenomeBiology, 8:R228)〇
[0006] 荧光原位杂交（FISH)、实时PCR和数字PCR(ddPCR)方法已用于检测基因拷贝数 变化，然而使用这些技术，可多重检测（样品、目的区域和变体类型）的程度受到限制。与 FISH、实时PCR和数字PCR技术相比，下一代测序具有进行明显更高程度的多重检测（全部 在单个测定中进行样品多重检测、靶区域多重检测和变体类型多重检测）的能力（参见例 如，（Castle等，（2010)BMCGenomics, 11:244;Wood等，NucleicAcidsResearch,第 38 卷，第 14 期，el51;Conway等，（2012)TheJournalofMolecularDiagnostics, 第 14卷，第 2期，pl04-lll)。
[0007] 此外，具体而言，FISH缺乏区分密切存在的局部改变的"精微"的分辨力。测序方 法例如全基因组测序已用于检测拷贝数改变（Xi等，PNAS108:E1128 (2011);Zong等， Science(2012)第338卷第114期第1622-1626页）。然而，这样的方法是耗时和昂贵 的，并需要大量的生物信息学分析以确定拷贝数改变。
[0008] 需要用于检测CNV的另外的方法。
[0009] 简述 本发明涉及用于检测基因组拷贝数变化的系统和方法。具体而言，本发明涉及用于检 测拷贝数变化的下一代测序方法。
[0010] 例如，在一些实施方案中，本发明提供确定目的核酸区域的染色体拷贝数变化 (例如，增加或减少（例如缺失））或基因表达变化（例如增加或减少）的方法，其包括：a) 从目的区域和至少一个对照区域扩增核酸以产生靶和对照扩增子；b)将靶和对照扩增子 测序以产生测序读出；和c)比较靶扩增子的水平与对照扩增子的水平。在一些实施方案 中，从靶核酸产生2个或更多个扩增子（例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多）。在一些实施 方案中，目的区域是少于全基因组的核酸区域（例如，染色体、染色体的臂、染色体的区域、 一个或多个基因或非编码区）。在一些实施方案中，至少一个对照区域包含在与目的区域相 同的染色体上的第一对照区域和在不同于目的区域的核酸（例如染色体）上的第二对照区 域。在一些实施方案中，所述比较包括将第一对照扩增子和第二对照扩增子的比率与靶扩 增子和第二对照扩增子的比率进行比较。在一些实施方案中，大于或小于第一对照扩增子 和第二对照扩增子的比率的靶扩增子和第二对照扩增子的比率指示目的区域的染色体拷 贝数变化或基因表达变化。在一些实施方案中，拷贝数变化为至少2倍（例如，至少5、10、 20、30、40或更多倍）。在一些实施方案中，目的区域的染色体拷贝数变化或基因表达变化 指示在受试者中的疾病（例如癌症）的诊断或预后。在一些实施方案中，预后是疾病发展 的可能性、疾病对治疗的反应、或疾病复发的可能性。在一些实施方案中，所述方法还包括 根据诊断或预后确定起作用的疗程。在一些实施方案中，目的区域是基因组DNA，和染色体 拷贝数变化是位于所述基因组DNA中的基因的增加或减少（例如缺失）。在一些实施方案 中，目的区域是mRNA，和基因表达变化是增加或减少的mRNA表达（例如，由于基因融合所 致）。在一些实施方案中，所述方法还包括在扩增期间或在扩增后加入核酸衔接头至扩增 子。在一些实施方案中，衔接头在扩增后连接或在扩增期间加入（例如，作为扩增引物的一 部分）。在一些实施方案中，测序是下一代测序。在一些实施方案中，进行45或更少（例如 40、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、20、15、10 或更少）个扩增循环。本发 明不受限于引物的具体类型。实例包括但不限于化学修饰的引物、荧光修饰的引物、功能引 物（融合引物）、序列特异性引物、随机引物、具有特异性和随机序列两者的引物、和DNA和 RNA引物。
[0011] 在进一步的实施方案中，本发明提供确定目的核酸区域的染色体拷贝数变化（例 如，增加或减少）或基因表达变化的方法，其包括：a)从目的区域以及第一和第二对照区 域扩增核酸以产生靶和对照扩增子；b)将靶和对照扩增子测序以产生测序读出；和c)比 较靶扩增子的水平和对照扩增子的水平。
[0012] 在另外的实施方案中，本发明提供确定目的核酸区域的染色体拷贝数变化（例 如，增加或减少）或基因表达变化的方法，其包括：a)从目的区域以及第一和第二对照区 域扩增核酸以产生靶以及第一和第二对照扩增子；b)将靶和对照扩增子测序以产生测序 读出；和c)将第一对照扩增子和第二对照扩增子的比率与靶扩增子和第二对照扩增子的 比率进行比较。
[0013] 在仍其它的实施方案中，本发明提供确定目的核酸区域的染色体拷贝数变化（例 如，增加或减少）或基因表达变化的方法，其包括：a)从目的区域和至少一个对照区域扩 增核酸以产生靶和对照扩增子，其中所述扩增利用衔接核酸；b)将靶和对照扩增子测序以 产生测序读出；和c)比较靶扩增子的水平和对照扩增子的水平。
[0014] 在另外的实施方案中，本发明提供确定目的核酸区域的染色体拷贝数变化（例 如，增加或减少）或基因表达变化的方法，其包括：a)从目的区域以及第一和第二对照区 域扩增核酸以产生靶以及第一和第二对照扩增子；b)将靶和对照扩增子测序以产生测序 读出；和c)将第一对照扩增子和第二对照扩增子的比率与靶扩增子和第二对照扩增子的 比率进行比较；和d)当检出大于或小于第一对照扩增子和第二对照扩增子的比率的靶扩 增子和第二对照扩增子的比率时，确定目的区域的拷贝数变化或表达改变。
[0015] 本发明还提供试剂盒，其包含以下的一种或多种或全部，基本上由以下的一种或 多种或全部组成，或由以下的一种或多种或全部组成：a)用于扩增靶核酸的第一组引物 对；b)用于扩增对照核酸的至少一组第二组引物；c)多个核酸衔接头；和任选地d)与核 酸衔接头特异性杂交的至少一种测序引物。在一些实施方案中，至少一组第二引物包含用 于扩增两个对照核酸（例如，在与靶核酸相同的染色体上的第一对照和在不同核酸（例如， 不同的染色体）上的第二对照）的两组引物。在一些实施方案中，所述第一组引物与目的 基因特异性杂交。在一些实施方案中，试剂盒还包含数据分析软件。
[0016] 本发明的实施方案提供测序靶扩增子和对照扩增子的方法，其包括：a)从靶和对 照核酸区域扩增靶和对照扩增子的文库；和b)使用大规模平行测序技术测序扩增子的文 库，以产生多个测序读出。在一些实施方案中，所述方法还包括当相对于对照区域，从靶区 域产生增加数量的测序读出时，检测靶核酸区域的拷贝数或表达的改变的步骤。
[0017] 本发明进一步提供试剂盒，其包含以下的一种或多种或全部，基本上由以下的一 种或多种或全部组成，或由以下的一种或多种或全部组成：a)用于扩增靶核酸的至少一组 第一组引物对；b)用于扩增第一和第二对照核酸的至少两组引物；c)多个核酸衔接头； 和d)与核酸衔接头特异性杂交的至少一种测序引物。
[0018] 本发明进一步提供试剂盒，其包含以下的一种或多种或全部，基本上由以下的一 种或多种或全部组成，或由以下的一种或多种或全部组成：a)用于扩增靶核酸的至少一组 第一组引物对；b)用于扩增第一和第二对照核酸的至少两组引物，其中第一对照核酸在与 靶相同的染色体上，和第二对照在与对照不同的核酸（例如不同的染色体）上；c)多个核 酸衔接头；和d)与核酸衔接头特异性杂交的至少一种测序引物。
[0019] 本发明另外提供组合物，其包含反应混合物，基本上由反应混合物组成，或由反应 混合物组成，所述反应混合物包含靶核酸、用于扩增靶核酸的至少一组第一组引物对、用于 扩增对照核酸的至少一组第二组引物、多个核酸衔接头和与核酸衔接头特异性杂交的至少 一种测序引物。
[0020] 根据本文包含的教导，对相关领域的技术人员而言，其它实施方案将是显而易见 的。
[0021] 附图简述 图1显示用于本发明的实施方案的CNV检测测定的示例性测定设计。
[0022] 图2显示用于本发明的实施方案的CNV检测测定的示例性测定设计。
[0023] 图3显示EGFR拷贝数扩增的理论结果。
[0024] 图4显示用包含不同量的肿瘤细胞的样品进行的EGFR拷贝数扩增为40的理论结 果。
[0025] 图5显示用包含不同量的肿瘤细胞的样品进行的EGFR拷贝数扩增为10的理论结 果。
[0026] 图6显示用包含不同量的肿瘤细胞的样品进行的EGFR拷贝数扩增为5的理论结 果。
[0027] 图7显示使用本公开内容的实施方案的方法的在测序后EGFR的CNV的检测。
[0028] 图8显示使用本公开内容的实施方案的方法的在测序后EGFR的CN