一种甲基苯丙胺人工抗原的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种甲基苯丙胺人工抗原的制备方法。
【背景技术】
[0002] 甲基苯丙胺（Methamphetamine)是一类中枢神经兴奋剂，是我国规定管制的精神 药品，具有欣快、警觉及抑制食欲之作用，重复使用会成癒。中毒症状包括多话、头痛、错乱、 高烧、血压上升、盗汗、瞳孔放大、食欲丧失。大剂量使用引起精神错乱，思想障碍，类似妄想 性精神分裂症，多疑、幻听、被害妄想等；长期使用导致器官性脑症候群。有高血压及脑中风 之危险。停用之脱癒症状包括精神呆滞、昏睡、易怒、烦躁不安、忧虑，有自杀的倾向。苯丙 胺药物强烈的兴奋作用使它们刚应用于临床不久就开始被滥用。从1932年起就有人为寻 求感官刺激而吸食安非他明。冰毒（甲基安非他明)虽然问世较晚，但是它见效快、药效维持 时间长的特点使它蔓延速度极快。1996年11月25日联合国禁毒署在上海召开的国际兴奋 剂专家会议上，一致认为苯丙胺类兴奋剂将逐步取代本世纪流行的鸦片、海洛因、大麻、可 卡因等常用毒品，成为21世纪全球范围滥用最为广泛的毒品。中国不生产苯丙胺类药物， 也严禁在临床上使用。其结构式为：
目前，对甲基苯丙胺的检测主要依靠高效液相色谱法（HPLC)，气相色谱（GC)，薄层色 谱（TLC)，质朴（M巧等，但是存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，不 能达到现代检测对快速，准确的要求。而免疫分析法可W弥补W上所有缺点，免疫分析法是 一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方 法，该方法的前提就是需要提供特异性的抗原和抗体。因此有必要提供一种有效的甲基苯 丙胺人工抗原的制备方法，制备的甲基苯丙胺人工抗原可用于免疫制备具有特异性的甲 基苯丙胺抗体，进一步用于检测。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足，提供一种甲基苯丙胺人工 抗原的制备方法，所制备的甲基苯丙胺人工抗原可进行动物免疫，取得相应的甲基苯丙胺 抗体，可用于各种甲基苯丙胺类免疫分析法的研究，为甲基苯丙胺类的检测提供更加方便 快速准确的途径。
[0004] -种甲基苯丙胺人工抗原的制备方法，其特征在于，包括W下步骤： (1)制备人工半抗原： (a)将盐酸甲基苯丙胺溶于纯化水，滴加DAS溶液，游离使之抑W9 ;用己酸己醋萃 取，减压转干，得到淡黄色油状液体产物I;TLC层析液：己酸己醋；石油離=1: 10 (v/v)。
[0005] (b)产物I加入苯溶解后，置于冰水浴中，滴加Η氣己酸酢880ul，滴加完毕后，室 温继续揽拌反应1小时；然后再转入8(T85°C的油浴中回流反应3小时。反应结束后，减压 蒸干，得粗产物。
[000引 （C)粗产物用柱色谱提纯，淋洗剂；己酸己醋；石油離=1 ; 15,展开剂：己酸己醋： 石油離=1: 10 (v/v)。收集纯产物，减压蒸干，得淡黄色产物II。
[0007] (d)产物II按比例加入二氯甲焼、了二酸酢后，转入冰水浴中，分3次加入Η氯 化铅。固体溶解后转入35-45°C的油浴中，冷凝回流反应15小时W上。反应结束后，加入 的冷水，按比例加入盐酸，揽拌均匀后，蒸干。溶于己酸己醋，用纯化水和饱和氯化 钢萃取。有机相减压蒸干，得粗产物。反应比例；产物II;了二酸酢；二氯甲焼；Η氯化铅： 盐酸=2. 3g;lg;20ml;3g;lml。
[0008] (e)粗产物用柱色谱提纯，淋洗剂；己酸己醋；石油離=1/10,1/2，1/1;展开剂： 95%己醇；氨水；二氯甲焼；1，4-二氧六环=8: 1: 10:l(v/v)。收集1/1组分，减压蒸干， 得甲基苯丙胺半抗原。
[0009] (2)制备甲基苯丙胺人工抗原： (f) 将甲基苯丙胺半抗原溶于N，N-二甲基甲醜胺中，加入N-居基玻巧醜亚胺、环己基 碳醜二亚胺，反应比例；甲基苯丙胺半抗原；N，N-二甲基甲醜胺；N-居基玻巧醜亚胺；环己 基碳醜二亚胺=l〇〇mg;5ml;50mg;90mg，室温揽拌反应18小时W上，反应结束后离必取上 清液记为A液； (g) 将氯化钢与十二水磯酸氨二钢、二水磯酸二氨钢W摩尔比为78. 3:4. 2:1溶于双 蒸水中，制备钢离子浓度为0.Imol/L的PBS缓冲液，pH为7. 2^7. 4 ; 化）将牛血清蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为20mg/ml的B液； (i) 将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1:5,得到的混合液在2-8°C条件 下静置保存过夜，得到人工抗原混合液； (j) 配置0. 5%碳酸钢溶液，用2N氨氧化钢调抑=12. 00,人工抗原混合液也调至 pH=12. 00。将人工抗原混合液于上述碳酸钢溶液中透析2天。
[0010] 化）将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离必取上清液即得到人 工抗原：甲基苯丙胺-牛血清蛋白。
[0011] 由于甲基苯丙胺的分子量较小，单独作用时不具有免疫原性或免疫原性较弱，因 此必须将其与大分子载体比如牛血清蛋白连接形成甲基苯丙胺抗原后，才能刺激机体产生 相应的甲基苯丙胺抗体。本发明在制备甲基苯丙胺人工抗原过程中，所选的位点和交联方 法都没有明显改变其结构，保留了抗原决定簇。在甲基苯丙胺半抗原和牛血清蛋白之间引 入桥结构，暴露抗原决定簇，所获得的甲基苯丙胺人工抗原保持了甲基苯丙胺的结构特异 性，有利于相应甲基苯丙胺抗体的产生。
[0012] 本发明的技术方案分为两步，第一步为半抗原的制备及检测：W甲基苯丙胺为原 料通过化学修饰，和了二酸酢反应得到含駿基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检 巧IJ;通过碳二亚胺法使之与牛血清蛋白度SA)结合制备甲基苯丙胺的人工抗原即甲基苯丙 胺-牛血清蛋白。其反应方程式如下：
本发明制备得到的甲基苯丙胺人工抗原可通过w下方法进行鉴定： 偶联物蛋白浓度的测定：精确量取Proteinstandard(BSA)分别配制成浓度为0. 2， 0. 4,0. 6,，0. 8, 1. 0, 1. 2, 1. 6mg/ml的标准系列浓度，混匀，取50ul各浓度标准蛋白溶液加 入到一次性比色杯中，加入250ulreagentA,混匀，再加入2. 0mlreagentB,反应10分钟 后W分光光度计测得吸光度。空白液为reagentA250ul加reagentB2.0ml。W0D值 为横坐标，浓度为纵坐标作标准曲线，得出标准曲线线性方程。精确量取样品量为50ul，加 入到一次性比色杯中，加入250ulreagentA，摇匀，再加入2. 0mlreagentB,反应10分钟 后W分光光度计测得吸光度。通过已得出的标准曲线求得样品浓度。本发明计算得甲基苯 丙胺抗原的蛋白浓度为11. 93mg/ml。
【附图说明】
[0013]图1是甲基苯丙胺人工抗原制备前后的紫外扫描图。
【具体实施方式】
[0014] 甲基苯丙胺人工抗原制备分为两步，第一步为半抗原的制备及检测：W甲基苯丙 胺为原料通过化学修饰，和了二酸酢反应得到含駿基的半抗原；第二步为人工抗原的制备 与检测：通过碳二亚胺法使之与牛血清蛋白度SA)结合制备甲基苯丙胺的人工抗原即甲基 苯丙胺-牛血清蛋白。
[001引 实施例1 (1)人工半抗原的制备： (a)将盐酸