一种抗手足口病特异性纳米抗体及其效价测定方法
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种抗手足口病抗体及其效价测定方法，具体地说，是一种抗手足口病特异性纳米抗体及其效价测定方法；属于免疫学技术领域。
【背景技术】
[0002]手足口病(Hand-foot-mouth disease, HFMD)是由多种肠道病毒引起的急性传染病，多发生于5岁以下的婴幼儿，成人也偶见发生，可引起发热和手、足、口腔等部位的皮疹、溃疡，具有很强的传染性，可以通过玩具、食具、鼻咽分泌物、飞沫等多种途径传染。其症状表现为:急性起病，发热，手或脚掌部出现斑丘疹和疱疹，臀部或膝盖也可以出现皮疹。皮疹周围有炎性红晕，疱内液体较少；口腔粘膜出现散在的疱疹，疼痛明显。部分患者伴有咳嗽、流涕、食欲不振、恶心、呕吐和头疼等症状。少数患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症，个别重症患者如果病情发展快，会导致死亡。
[0003]引发手足口病的肠道病毒有20多种，其中肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CoxA16)最为常见。1957年在新西兰首次报道，1958年分离出柯萨奇病毒，1959年提出HFMD命名，60年代以后，许多国家和地区多次报道该病的流行。早期发现的手足口病的病原体主要是CoxA16型，1969年分离并首次确认EV71病毒。1981年在上海首次报道本病。此后，北京、河北、天津、福建、吉林和广东等10几个省市均有报道。1995年武汉病毒研究所从手足口病人中分离出EV71，1998年深圳市卫生防疫站从患者标本中分离出EV71病毒。
[0004]1993年，Hamers-Casterman等报道了在胳驻科动物(单峰驻、双峰驻、美洲驻等)体内存在一种只含重链不含轻链的天然重链抗体(Heavy chain antibody, HCAb)。
[0005]由于骆驼重链抗体是纯天然的，不能直接作用于人，或者为人类所用。因此克隆骆驼体内重链抗体的可变区后，得到的仅有一个重链可变区组成的单域抗体，称之为重链可变区基因抗体(Variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody, VHH), VHH抗体是迄今为止发现的具有结合抗原功能的最小分子量抗体片段，分子量为15KD，仅为常规抗体的1/10，其分子高度4.8nm，直径2.2nm，故又被称为纳米抗体(Nanobody)。
[0006]目前，虽然已有针对预防HFMD的疫苗等，临床用药主要有抗病毒药、中药和抗菌药等，治疗效果不理想，而且有副作用，影响儿童健康。此外，虽现已有治疗手足口病的抗体，但是由于传统抗体的一些缺点，如:纯度低、稳定性差及特异性差等特点，使其在治疗手足口病方面有了一定的局限性。因此，本发明的抗手足口病特异性纳米抗体不但能有效治疗手足口病，而且相比于传统抗体而言，具有其独特的优点。
【发明内容】
[0007]针对上述不足，本发明的目的在于提供一种分子量小、水溶性好、特异性强、稳定性高的抗手足口病特异性纳米抗体，本发明还提供该抗手足口病特异性纳米抗体的效价测定方法。
[0008]为解决上述技术问题，本发明提供的前一个技术方案是这样的:
[0009]—种抗手足口病特异性纳米抗体，所述的抗手足口病特异性纳米抗体依次通过下述步骤制得:
[0010]1)采用灭活纯化的EV71型病毒株制成可溶性抗原；
[0011]2)用0.01M的磷酸盐缓冲液将步骤1)制备的可溶性抗原配成0.8-1.2mg/ml抗原液，与弗氏完全佐剂按体积比1:0.8-1.2充分乳化后制得免疫抗原；
[0012]3)采用步骤2)制备的免疫抗原多点注射双峰骆驼背部皮下，平均500-700 μ L/只，免疫周期为12-18天，中间加强免疫3次，采用初免相同免疫方法和剂量，免疫4个周期后，静脉取血，收集血清，3-5°C冰箱保存备用；
[0013]4)将收集到的血清，通过PEG三步沉淀法和改进水体综合PEG法进行纯化，得到纳米抗体。
[0014]上述的抗手足口病特异性纳米抗体，步骤1)所述的制备抗原是将EV71病毒液接种到生长至单层的横纹肌肉细胞中，每瓶加0.5mL，放入0)2培养箱中培养至90%左右细胞出现细胞病变时收获，_15-25°C冻融2-4次，3-5°C时以6000-10000rpm离心0.5-1.5h，收集病毒液3-5°C lOOOOrpm离心1.5-2.5h，弃上清，沉淀用PBS缓冲液悬浮；
[0015]2) CsCl密度梯度离心纯化病毒抗原
[0016]将CsCl装入梯度离心管中，轻轻吹打至溶解，3-5°C时以12000-18000rpm离心10-15h，3-5°C保存过夜，次日3-5°C 18000-22000rpm离心3_5h，以去除残余CsCl和上清液，加入PBS稀释纯化病毒液3-5°C，即得可溶性抗原。
[0017]进一步的，上述的抗手足口病特异性纳米抗体，步骤2)所述的磷酸盐缓冲液pH7.0-7.8o
[0018]进一步，上述的抗手足口病特异性纳米抗体，步骤3)所述的加强免疫采用初免相同免疫方法和剂量。
[0019]进一步，上述的抗手足口病特异性纳米抗体，步骤4)所述的PEG三步沉淀法是PEG粉末加入到骆驼血清中使其终浓度为3-6%，调PH值至7.0-7.5，充分混匀后3_5°C，离心分离后过滤，弃沉淀；取上清液中加入PEG粉末使其终浓度为8.0-10.0%，调PH值至7.0-7.5，充分混匀后3-5°C，离心分离后过滤，弃上清液，沉淀用3-5°C PBS缓冲液溶解后再加入PEG至终浓度为10-18%，离心分离后过滤后再次弃上清，再用PBS溶解沉淀，转入透析袋，透析48h以上，每12h更换一次透析液，最终收集截留物质，-50-60°C真空冷冻干燥至粉末，_20°C保存。
[0020]进一步，上述的抗手足口病特异性纳米抗体，步骤4)所述的改进水体综合PEG法是骆驼血清与3-5°C冻存蒸馏水2:6-10混匀，调PH值至5.0-5.5，冰箱3_5°C静置过夜；3-5 °C离心分离后过滤后取沉淀。
[0021]进一步，上述的抗手足口病特异性纳米抗体，所述的PEG粉末为PEG 6000粉末。
[0022]本发明还有一个技术方案是提供该抗手足口病特异性纳米抗体的效价测定方法，该方法依次包括下述步骤:
[0023]1)包被
[0024]将纯化过的EV71病毒抗原用0.01M PBS 1:1000稀释至最佳包被溶度后包被于96孔酶标板上，37°C温育lh后，4°C过夜，次日甩干孔中液体，用PBST洗涤1次，吸水纸拍干；
[0025]2)封闭
[0026]用含3%脱脂奶粉的0.01M PBS液封闭，37°C温育lh后甩干，PBST洗涤3次，每次2-5min，吸水纸拍干；
[0027]3)加一抗
[0028]骆驼抗体血清用0.01M PBS 倍比系列 1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1: 32000、1:64000、空白PBS稀释后加入96孔酶标板，PBS作为空白对照，37°C温育lh,甩干，PBST洗涤3次，每次2-5min，吸水纸拍干；
[0029]4)加酶标二抗
[0030]每孔加入用0.01MPBS 1:8000稀释的兔抗骆驼抗体100 μ L，置37°C温育lh后甩干，PBST洗涤3次，每次2-5min，吸水纸拍干；
[0031]5)显色和读数
[0032]用新鲜配制的TMB显色液，置37°C温育显色约15min后，每孔加50 μ L 2Μ H2S04if液终止反应，立即用酶标仪测定各孔在0D 450nm处吸光值，以免疫骆驼抗体与未免疫骆驼抗体阴性对照0D值之比大于2.1，且阴性骆驼抗体吸光值大于0.1做为抗体阳性的判定阈值，阳性孔0D值多2.1倍阴性孔0D值的最高稀释倍数为骆驼抗体的效价。
[0033]与现有技术相比，本发明所制备的纳米抗体，具有分子量小、可水溶性好、特异性强等特点；且耐热、耐酸，稳定性高。这些独特的优点使纳米抗体在临床和基础科学的应用中起着重要的作用。因此，纳米抗体在肿瘤的诊断和治疗、食品科学、抗病毒等领域都有较大的应用价值与前景。
【附图说明】
[0034]图1是抗EV71病毒纳米抗体纯化分析图；
[0035]图2是抗EV71病毒纳米抗体效价消长规律图；
[0036]图3是双向免疫琼脂扩散图；
[0037]图4是蛋白印迹分析抗EV71病毒纳米抗体图；
[0038]图5是特异性纳米抗体体外中和活病毒分析图。
【具体实施方式】
[0039]下面结合【具体实施方式】，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求保护范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。
[0040]实施例1
[0041]抗手足口病纳米抗体的制备
[0042]1、抗原制备
[0043]1)将EV71病毒液接种到生长至单层的RD (横纹肌肉细胞)细胞中，每瓶加0.5mL，放入0)2培养箱中培养至90%左右细胞出现CPE(细胞病变)时收获，-20°C冻融3次，4°C 8000rpm，lh离心，收集上清液(病毒液)，4°C lOOOOrpm离心2h，弃上清，沉淀用PBS缓冲液悬浮。
[0044]2) CsCl密度梯度离心纯化病毒抗原
[0045]称取3.2g CsCl装入7.6mL梯度离心管中，轻轻吹打至溶解，水平转头4°C 15000rpm，离心12h，4°C保存过夜。次日4°C 20000rpm离心4h，以去除残余CsCl，弃上清，加入300 μ L PBS稀释纯化病毒液4°C保存。
[0046]2、免疫
[0047]用PBS溶解纯化后EV71抗原，配成lmg/ml溶液。取上述溶液0.6ml与弗氏完全佐剂按1:1混合后充分乳化，采用背部皮下多点注射双峰驼，600 μ L/只；免疫周期为15天，加强免疫3次，加强免疫采用弗氏不完全佐剂与病毒液按1:1乳化，采用初免相同免疫方法和剂量。加强免疫3次后收集血清，分装后，4°C冰箱保存备用。
[0048]3、纳米抗体的分离纯化
[0049]分别采用PEG三步沉淀法和改进水体综合PEG法纯化免疫后获得的骆驼血清蛋白。结果见图1。
[0050]1)PEG三步沉淀法:PEG 6000粉末加入到骆驼血清中使其终浓度为4.5%，调PH值至7.2，充分混匀后4°C，8000rpm离心30min，过滤，弃沉淀。上清液中加入PEG 6000粉末使其终浓度为9.0%，调PH值至7.2，充分混匀后8000rpm 4°C离心30min，弃上清液。沉淀用适量4°C PBS缓冲液(