响应的荧光单分子共轭聚合物及胶束、制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种Η202响应的荧光单分子共轭聚合物及胶束、制备方法和应用，所述荧光单分子共轭聚合物胶束可用于鉴别肿瘤细胞和正常细胞。
【背景技术】
[0002]近年来，与癌症相关的分子成像在癌症的诊断和治疗中起到越来越重要的作用。h202作为细胞传导的第二信使参与各种生理过程的调节。任何因环境压力或基因突变引起的h202的异常产生和积累，都会导致一些疾病的产生，包括癌症、老化、心血管疾病、阿茨海默症、帕金森氏症等疾病。倘若能对细胞内h202检测与成像，将对疾病诊断、预防和病理研究具有十分重要的意义。
[0003]为实现对H202检测与成像，大量文献报道了基于“荧光开-关”型的小分子Η 202探针 dc.Chem.Res.2011, 44, 793-804 \B1sens.B1elec tron.2014, 56, 58-63 \ J.Am.Chem.Soc.2011，133, 10960-10965 -J.Am.Chem.Soc.2011，133, 10629-10637等)，然而，这种小分子“荧光开-关”型H202探针往往会因为探针本身严重的光漂白性、高的浓度依赖性和设备因素(照明稳定性)而引起数据失真，最终影响探针的灵敏度。
【发明内容】
[0004]近年来，共轭聚合物由于荧光量子产率高、光稳定性好和“分子导线”的信号放大等优点，使其迅速成为荧光传感器领域的研究前沿，尤其是基于FRET效应的含有荧光“供体-受体”单元的共轭聚合物，在FRET的效应下，可以构筑成为灵敏度高、选择性强的“荧光比率”探针。因此，为了突破上述的传统小分子“荧光开-关”型H202探针的局限性，本发明构建了一种基于共轭聚合物的“荧光比率”型H202探针，用于活细胞内H 202成像与检测。
[0005]本发明提供一种H202响应的荧光单分子共轭聚合物及其胶束，以解决现有技术中的传统小分子“荧光开-关”型H202探针因探针本身严重的光漂白性、高的浓度依赖性和设备因素(照明稳定性)而引起的数据失真，最终影响探针灵敏度等技术性问题。
[0006]本发明还提供上述H202响应的荧光单分子共轭聚合物的制备方法。
[0007]本发明还提供上述H202响应的荧光单分子共轭聚合物的制备中间体及胶束。
[0008]本发明还提供上述H202响应的荧光单分子共轭聚合物胶束在H 202检测、细胞内H202成像、肿瘤细胞和正常细胞的鉴别方面的应用。
[0009]本发明之目的通过以下技术方案实现:
一种H202响应的荧光单分子共轭聚合物，其包括疏水的超支化共轭聚合物核与亲水的聚合物臂，所述的疏水的超支化共轭聚合物核与亲水的聚合物臂之间通过H202响应的硼酸酷键连接。
[0010]优选地，所述疏水的超支化共轭聚合物核主要由FRET供体单体(如蓝色荧光)、FRET受体单体(如绿色荧光)和支化单体制备得到。
[0011]优选地，所述FRET供体单体为基于芴的含溴和/或硼酸基团的双官能团的单体，所述FRET受体单体为基于2，1，3-苯并噻二唑的含溴和/或硼酸基团的双官能团单体，所述支化单体为含三个或以上溴和/或硼酸基团官能团的单体。
[0012]在本发明的一些实施例中，所述FRET供体单体选自下列单体的一种或几种:9，9- 二正己基_2，7- 二棚酸荷、9，9- 二正己基_2，7- 二漠荷、9，9- 二正辛基-2，7~ 二硼酸芴、正己基)-3,6-二硼酸咔唑、正辛基)-3,6-二硼酸咔唑、9，9-二正己基-2-溴-7-硼酸芴、9，9- 二正辛基-2-溴-7-硼酸芴、正己基)-3_溴_6_硼酸咔唑，或十(正辛基)-3-溴-6-硼酸咔唑等等，任何相关类似的单体都应落在本申请的保护范围内。
[0013]在本发明的一些实施例中，所述FRET受体单体选自下列单体的一种或两种:4，7-二溴-2，1，3-苯并噻二唑或4-溴-7-硼酸-2，1，3-苯并噻二唑等等，任何相关类似的单体都应落在本申请的保护范围内。
[0014]在本发明的一些实施例中，所述支化单体选自下列单体的一种或两种:1，3，5_三溴苯或1-硼酸_3，5- 二溴苯等等，任何相关类似的单体都应落在本申请的保护范围内。
[0015]优选地，所述亲水的聚合物臂包括亲水的聚乙二醇。
[0016]所述H202响应的荧光单分子共轭聚合物在水介质中能够自组装形成单分子胶束，并且所述单分子胶束以进一步组装成荧光单分子共轭聚合物胶束，该荧光单分子共轭聚合物胶束在水介质中能够对H202特异性地响应。
[0017]—种上述的H202响应的荧光单分子共轭聚合物的制备方法，包括以下步骤:
(1)将FRET供体单体、FRET受体单体与支化单体在催化剂作用下进行Suzuki交叉偶联反应，得到超支化共轭聚合物一；其中，尽量保证所有原料中的总溴和/或硼酸基团官能团等摩尔比；
优选地，步骤(1)中所述FRET受体单体的摩尔投料比为:受体单体/ (供体单体+受体单体)=5% ;相对于2mmol的供体单体+受体单体，支化单体的投料量为0.1-0.5 mmol，优选为 0.1 mmol η
[0018](2)继续额外加入催化剂以及作为封端剂的含两个硼酸基团的供体单体，封端聚合物，得到端基为硼酸基团的超支化共轭聚合物二；
优选地，步骤(1)和(2)中的聚合反应是Suzuki交叉偶联反应，反应的油相是甲苯，水相是Na2C03溶液，催化剂为Pd (PPh 3) 4。
[0019]步骤(2)中额外加入的封端剂选自下列单体的一种或几种:9，9_ 二正己基-2，7- 二硼酸芴、9，9- 二正辛基-2，7- 二硼酸芴或正己基)-3，6- 二硼酸咔唑；
(3)采用三元醇对超支化聚合物端基的硼酸进行酯化，得到含硼酸酯键并有大量端羟基的超支化共轭聚合物三；三元醇对硼酸进行酯化的反应，采用官能团等摩尔比反应；
优选地，三元醇可选自下列单体的一种或几种:丙三醇、1，2，4- 丁三醇、1，2，5-戊三醇、1，2，6-己三醇、1，2，7-庚三醇和1，2，8-辛三醇等等，任何相关类似的三元醇都应落在本申请的保护范围内。
[0020]优选地，步骤(1)、(2)和(3)中的反应温度均为111_125°C，步骤(1)、(2)和(3)中的反应时间分别为1至5天、1至3天和4小时至2天。[0021 ] 步骤(1)、( 2 )和(3 )中的反应溶剂均为甲苯；步骤(2 )和(3 )的反应产物使用有机溶剂进行后处理，之后干燥；其中，所述有机溶剂选自四氢呋喃、无水甲醇、正己烷和丙酮的一种或几种；所述干燥过程使用的除水干燥剂为无水硫酸镁。
[0022](4)将所述含大量端羟基的超支化共轭聚合物三在强碱存在下与聚乙二醇单甲醚对甲苯磺酸酯(PEG-OTs)反应，得到含硼酸酯键的星状共轭聚合物，即所述H202响应的荧光单分子共轭聚合物。
[0023]优选地，步骤(4)中所用的强碱为氢化钠。步骤(4)中的反应温度为68至95°C，反应时间为1至3天，反应溶剂为四氢呋喃，PEG-OTs为分子量大于1000的聚乙二醇单甲醚对甲苯磺酸酯。反应产物使用有机溶剂进行后处理，有机溶剂选自正己烷、无水甲醇和乙醇的一种或几种。
[0024]优选地，将所述制备得到的含硼酸酯键的星状共轭聚合物通过如下方法制备荧光单分子共轭聚合物胶束水溶液:将含硼酸酯键的星状共轭聚合物溶解在有机溶剂中，在室温下将其滴入超纯水中并不断搅拌进行胶束组装，除去有机溶剂，得到荧光单分子共轭聚合物胶束水溶液。优选地，所述有机溶剂选自四氢呋喃和-二甲基甲酰胺。优选地，所述组装的时间是0.5至12小时，组装温度是15至30°C。在本发明的一实施例中，所述除去有机溶剂透析过程使用的透析袋的截留分子量为3500，透析水为超纯水。
[0025]本发明还请求保护一种上述的步骤(2)制备得到的超支化共轭聚合物二。
[0026]本发明还请求保护一种上述的步骤(3)制备得到的超支化共轭聚合物三。
[0027]本发明还请求保护一种上述制备得到的荧光单分子共轭聚合物胶束水溶液。
[0028]本发明还请求保护上述的H202响应的荧光单分子共轭聚合物及其胶束在H 202检测、细胞内H202成像、肿瘤细胞和正常细胞的鉴别方面的应用。
[0029]特别地，所述的荧光单分子共轭聚合物胶束在肿瘤细胞和正常细胞的鉴别方面的应用为，所述的荧光单分子共轭聚合物胶束对肿瘤细胞和正常细胞内的H202具有不同颜色的荧光成像。在一实施例中，所述的荧光单分子共轭聚合物的组装胶束对肿瘤细胞显示绿色荧光成像，而对正常细胞显示蓝色荧光成像。
[0030]所述的荧光单分子共轭聚合物胶束进入肿瘤细胞后，在肿瘤细胞内高浓度H202环境下，荧光单分子共轭聚合物的亲水的聚合物臂断裂，疏水的超支化共轭聚合物核因失去聚合物臂的保护而聚集，引起超支化分子间与分子内FRET显著增强，并伴随荧光从蓝色到绿色的改变，以实现肿瘤细胞绿色荧光成像。
[0031]所述的荧光单分子共轭聚合物胶束利用肿瘤细胞较正常细胞内H202含量高的差异，特异性地仅对肿瘤细胞内H202响应并启动FRET效应，呈现受体的绿色荧光；而对正常细胞内低的H202含量没有响应，不能开启FRET效应，只能呈现供体的蓝色荧光。鉴于共轭聚合物胶束对肿瘤细胞和正常细胞内H202具有颜色不同的荧光成像，本发明可以实现鉴别肿瘤细胞和正常细胞的目的。
[0032]所述的肿瘤细胞可为宫颈癌细胞、乳腺癌细胞、黑色素瘤细胞、肺癌细胞，肾癌细胞、胰腺癌细胞、淋巴瘤细胞和骨髓瘤细胞中的一种。
[0033]本发明的H202响应的“荧光比率”型单分子共轭聚合物胶束作为探针，具有以下优势:
1、由于本发明“荧光比率”型H202探针优异的光稳定性，对探针浓度、环境及设备因素的无依赖性，可以有效地避免传统小分子“荧光开-关”型h202探针因探针本身严重的光漂白性、浓度依赖性和设备因素(照明稳定性)而引起的数据失真和灵敏度低