原生藻菌的转化方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请号为201080042308. 2,申请日为2010年9月24日，发明名称为"原 生藻菌的转化方法"的中国专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明设及原生藻菌（stramenopile)的转化方法。本发明还设及通过导入脂肪 酸不饱和化酶基因，不饱和脂肪酸含量增加的原生藻菌，从运些不饱和脂肪酸含量增加的 原生藻菌生产不饱和脂肪酸的方法等。
【背景技术】
[0003] 多不饱和脂肪酸（polyunsaturatedfattyacid,PUFA)是动物和人类营养中重 要的成分。由于如二十碳五締酸巧PA)或二十二碳六締酸值HA)运样的ω3多不饱和脂肪 酸（也称作η-3多不饱和脂肪酸）在儿童脑的发育、眼的机能、激素和其它信号物质的合成 W及包括屯、血管障碍、癌症和糖尿病的预防的健康状况中实现各种作用（非专利文献1)， 因此它们是人类营养中的重要成分。由于运样的原因，多不饱和脂肪酸的制造已成为必要。
[0004] 一方面，已知分类于网粘菌化油yrinthula)纲的微生物制造多不饱和脂肪 酸。已经报道属于破囊壶菌（T虹austochytriales)科的微生物中，利用裂殖壶菌 (Schizochytrium)属的微生物的含有多不饱和脂肪酸的憐脂的制备方法（专利文献1)， 具有二十二碳六締酸生产能力的破囊壶菌灯虹austochytrium)属的微生物（专利文献2) 等。由于运些不饱和脂肪酸使得食物和/或饲料的强化成为可能，因此运些不饱和脂肪酸 的，特别是在真核生物中的，简便经济的制造方法是非常必要的。 阳0化]在网粘菌类中，作为外源基因的导入方法，已经报道了对于裂殖壶菌属的特定菌 株（按照现在的分类体系（非专利文献2)属于Auranthiochytrium属（非专利文献3)) 的方法（专利文献3、4)。而且，作为通过转化使得脂肪酸组成变化的方法，虽然已知有破坏 聚酬合成酶（PK巧系基因，其结果是脂肪酸组成变化的例子（非专利文献4)，但是，至今未 知操作构成延长酶/去饱和酶通路的酶使得脂肪酸组成变化的报道。
[0006] 现有技术文献
[0007] 专利文献
[0008] 专利文献1 :日本特开2007-143479号公报
[0009] 专利文献2 :日本特开2005-102680号公报
[0010] 专利文献3 :日本特开2006-304685号公报 W11] 专利文献4 :日本特开2006-304686号公报
[0012] 专利文献5 :日本特开2005-287380号公报
[0013]专利文献 6 :PCT/DK96/00051
[0014] 非专利文献
[0015]非专利文献 1 :Poulos,ALipids30:1-14, 1995 ;Horrocks，LA和Yeo ΥΚ,PharmacolRes40:211-225,1999
[0016] 非专利文献 2:YokoyamaR. ,HondaD. ,Mycoscience48:199-211, 2007
[0017] 非专利文献3 :第60届日本生物工程学会大会讲演要旨集，pl36, 2008
[00化]非专利文献 4 :Lippmeie;rJC等人，Lipids.,Jul;44 (7) : 621-30. (2009),化址)2009Jun3.
[0019] 非专利文献 5 :阳BSLett. 553, 440-444 (2003)
[0020] 非专利文献 6:NucleicAcidsRes. (1994)22,4673-4680)
[0021] 非专利文献 7 :Prasher,D.C.等人，Gene, 111 (2) : 229-233 (1992)
[0022] 非专利文献 8:ChalfieΜ.等人，Science, 263:802-805,（1994)
[0023]非专利文献 9 :Southe;rn,P.J.,和Berg,P. ,J.Molec.Appl.Gen. 1, 327-339. (1982)
[0024] 非专利文献10 才实验^号スhk^テッK2遺伝子解析①基礎P63-68,秀 润社
[00巧]非专利文献 11danger,F.,等人Proc.化tl.Acad.Sci(1977) 74, 5463
[0026] 非专利文献12 才实验^号スhk^テッΚ2遺伝子解析①基礎P117-128， 秀润社
[0027]非专利文献 13 :Adachi,J.等人Comput.Sci.Monogr. (1996) 28
【发明内容】
阳0測发明概述
[0029] 发明所解决的课题
[0030] 本发明目的是为了使原生藻菌的有用物质的产生能力提高而导入外源基因进行 转化。通过导入与原生藻菌的有用物质的产生有关的外源基因，改变有用物质的产生能力 本发明目的为改变原生藻菌产生的脂肪酸组成的方法，使原生藻菌蓄积大量的脂肪酸的方 法，不饱和脂肪酸的制造方法，不饱和脂肪酸含量增加的原生藻菌，从运些不饱和脂肪酸含 量增加的原生藻菌生产提供不饱和脂肪酸。通过本发明，提供了改变原生藻菌产生的脂肪 酸组成和使原生藻菌蓄积大量脂肪酸的方法，使得更加有效地制造多不饱和脂肪酸成为可 能。
[0031] 解决课题的方法
[0032] 本发明人，借鉴上述现有技术的状况专屯、研究的结果，为了使原生藻菌产生大量 不饱和脂肪酸的能力提高，成功地导入外源基因进行转化，并且，发现了通过向原生藻菌导 入脂肪酸不饱和化酶基因，并使其表达进行原生藻菌产生的脂肪酸组成的改变的方法，W 及使得该转化的原生藻菌蓄积大量的不饱和脂肪酸的方法，并通过进一步促进其实用化目 的的研究、开发，直至完成了本发明。
[0033] 本发明将W下（1)~（22)记载的技术事项作为要点。
[0034] (1) 一种原生藻菌的转化方法，其特征在于向原生藻菌中导入外源基因。
[0035](2)根据（1)所述的原生藻菌的转化方法，其中所述原生藻菌为网粘菌类。 W36] 做根据似所述的原生藻菌的转化方法，其中所述网粘菌类为属于网粘 菌属（Labyrinthula)、交链抱霉属（Altornia)、Aplanochytrium、Japonochytrium、 Labyrinthuloides、裂殖壶菌属（Schizochytrium)、海洋壶菌属（Aurantiochytrium)、 破囊壶菌属（Thraustochytrium)、吾肯氏壶菌属（叫kenia)、Obion邑ichytrium、Botryochytrium、Parietichytrium、或Sicyoidochytrium的微生物。
[0037] (4)根据（1)至（3)任一项所述的原生藻菌的转化方法，其中所述微生物是裂殖 壶菌（Schizochytriumsp. )M-8 株（阳RMP-19755)、金黄色破囊壶菌灯虹austochytrium aureum)ATCC；34304、破囊壶菌灯虹austochytriumsp. )ATCC26185、裂殖壶菌 (Schizochytriumsp. )ALlAc、裂壶藻（Schizochytriumaggregatum)ATCC28209、吾肯氏 壶菌Onkeniasp. )ATCC28207、裂殖壶菌（Schizoch5rtriumsp. )S邸210(NBRC102615)、 裂殖壶菌（Schizochytriumsp.)S邸345 (NBRC102616)、BotiTochytriumradia1:um S邸353(NBRC104107)、或ParietichytriumsarkarianumS邸364(阳RMABP-11298)。
[0038] (5)根据（1)至（4)任一项所述的原生藻菌的转化方法，其中所述外源基因为与抗 生素耐受能力、发色蛋白质、和/或脂肪酸不饱和化酶相关联的基因。
[0039] (6)根据（1)至（5)任一项所述的原生藻菌的转化方法，其中与脂肪酸不饱和化酶 相关联的基因为A5去饱和酶基因、Δ5去饱和酶基因、和/或ω3去饱和酶基因。
[0040] (7)根据（1)至（6)任一项所述的原生藻菌的转化方法，其特征在于利用电穿孔或 基因枪法导入外源基因。
[0041] (8) -种改变原生藻菌脂肪酸组成的方法，其特征在于导入脂肪酸不饱和化酶基 因，并表达该脂肪酸不饱和化酶。
[0042] (9)根据（8)所述的方法，其中脂肪酸不饱和化酶是去饱和酶。
[0043] (10)根据（8)或（9)所述的方法，其中脂肪酸不饱和化酶是Δ5去饱和酶、Δ5去 饱和酶、或ω3去饱和酶。 W44] (11)根据做至（10)任一项所述的方法，其中所述原生藻菌为网粘菌类。 W45](。）根据（11)所述的方法，其中所述网粘菌类为属于网粘菌属化油yrinthula)、 交链 抱霉属（Altornia)、Aplanochytrium、Japonochytrium、Labyrinthuloides、 裂殖壶菌属（Schizoch}ft;rium)、海洋壶菌属（Aurantiochytrium)、破囊壶菌属 (Thraustochytrium)、吾肯氏壶菌属（Ulkenia)、Oblongichytrium、Botryochytrium、 Parietichytrium、或Sicyoidochytrium的微生物。
[0046] (13)根据（12)所述的方法，其中所述微生物是裂殖壶菌（Schizochytriumsp.) M-8 株（阳RMP-19755)、金黄色破囊壶菌灯虹austochytriumaureum)ATCC：M304、破囊 壶菌灯虹austochytriumsp.)ATCC26185、裂殖壶菌（Schizoch}ft;riumsp.)ALlAc、裂壶 藻（Schizoch}ft;riumaggregatum)ATCC28209、吾肯氏壶菌化化eniasp.)ATCC28207、 裂殖壶菌（Schizoch}ft;riumsp. )S邸210(NBRC102615)、裂殖壶菌（Schizoch}ft;rium sp.)SEK345(NBRC102616)、Bot巧ochytriumradiatumSEK353(NBRC104107)、或 ParietichytriumsarkarianumS邸364(阳RMABP-11298)。
[0047] (14)通过（8)至（13)任一项所述的方法使原生藻菌大量蓄积脂肪酸的方法。
[0048] (15)根据（14)所述的方法，其中所述脂肪酸为不饱和脂肪酸。
[0049] (16)根据（15)所述的方法，其中所述不饱和脂肪酸为碳原子数在18-22的不饱和 脂肪酸。
[0050] (17)通过（14)至（16)任一项所述的方法得到的脂肪酸。
[0051] (18)W脂肪酸组成的改变为目的被转化的原生藻菌。
[0052] (19)W使脂肪酸大量蓄积为目的被转化的原生藻菌。
[005引 （20)根据（18)或（19)所述的原生藻菌，其为网粘菌类。
[0054] (21)根据（20)所述的原生藻菌，其中所述网粘菌类为属于网粘菌属 (L曰byrinthul曰）、交链 抱霉属（Altorni曰）、Apl曰nochytrium、Japonochytrium、Labyrinthuloides、裂殖壶菌属（Schizochytrium)、海洋壶菌属（Aurantiochytrium)、 破囊壶菌属（Thraustochytrium)、吾肯氏壶菌属（叫kenia)、Obion邑ichytrium、 Botryochytrium、Parietichytrium、或Sicyoidochytrium的微生物。 阳化日](22)根据（21)所述的原生藻菌，其中所述微生物是裂殖壶菌（Schizochytrium sp. )M-8 株（阳RMP-19755)、金黄色破囊壶菌灯虹austochytriumaureum)ATCC；34304、破 囊壶菌（T虹austochytriumsp. )ATCC26185、裂殖壶菌（Schizoch}ft;riumsp. )ALlAc、裂 壶藻（Schizochytriumaggregatum)ATCC28209、吾肯氏壶菌 〇J化eniasp.)ATCC28207、 裂殖壶菌（Schizoch}ft;riumsp. )S邸210(NBRC102615)、裂殖壶菌（Schizoch}ft;rium sp.)SEK345(NBRC102616)、BotryochytriumradiatumSEK353(NBRC104107)、或 ParietichytriumsarkarianumS邸364(阳RMABP-11298)。
[0056] 发明效果
[0057] 通过本发明，W下成为可能：导入与原生藻菌的有用物质（不饱和脂肪酸）的产 生有关的外源基因而改变有用物质的产生能力，通过该改变，改变原生藻菌产生的脂肪酸 组成的方法，使原生藻菌蓄积大量脂肪酸的方法，不饱和脂肪酸的制造方法，提供不饱和脂 肪酸含量增加的原生藻菌，从运些不饱和脂肪酸含量增加的原生藻菌生产提供不饱和脂肪 酸。通过改变原生藻菌产生的脂肪酸组成，W及提供使原生藻菌蓄积大量脂肪酸的方法，能 够更加有效地制造多不饱和脂肪酸。
【附图说明】
[0058] 图1表示显示敏感性的抗生素筛选结果。其中，A为金黄色破囊壶菌，B为破囊 壶菌，C为血0186,D为ALlAc。另外，X轴的项目名从左侧开始按照如下的顺序：对照 G418(2mg/ml)、博来霉素（Img/ml)、嚷岭霉素（lOOyg/ml)、杀稻攝菌素（lOOyg/ml)、潮 霉素（2mg/ml)、氯霉素（30yg/ml)、卡那霉素（50yg/ml)、青霉素巧00yg/ml)、链霉素 巧00μg/ml)、四环素（100μg/ml)。
[0059] 图2表示金黄色破囊壶菌化aureum)在液体培养时的最低抑菌浓度。其中，A为 G418-0. 5mg/ml~，B为潮霉素-1.Omg/ml~，C为杀稻攝菌素-75μg/ml~。 W60] 图3表示破囊壶菌（T虹austochytriumsp.)在液体培养时的最低抑菌浓度。其 中，A为G418-lmg/ml~，B为潮霉素-0. 3mg/ml~，C为杀稻攝菌素-0. 6mg/ml~，D为博 来霉素-70μg/ml~。 阳06U 图4表示血0186在液体培养时的最低抑菌浓度。其中，A为G418-0. 175mg/ml~， B为潮霉素-0. 8mg/ml~，C为博来霉素-8μg/ml~。 阳06引 图5表示ALlAc在液体培养时的最低抑菌浓度。其中，A为G418-0. 6mg/ml~，B 为潮霉素-32μg/ml~，C为杀稻攝菌素，D为博来霉素，杀稻攝菌素W及博来霉素需要较高 浓度。
[0063]图6表示金黄色破囊壶菌化aureum)在平板培养时的最低抑菌浓度。其中， G418-lmg/ml~，潮霉素-2mg/ml~，杀稻攝菌素-0. 4mg/ml~。 W64] 图7表示破囊壶菌（T虹austochytriumsp.)在平板培养时的最低抑菌浓度。其 中，G418-1. 5mg/ml~，潮霉素-6mg/ml~，杀稻攝菌素-1. 4mg/ml~，博来霉素需要较高浓 度。 W65] 图8表示血0186在平板培养时的最低抑菌浓度。其中，G418-0. 5mg/ml~，潮霉 素-2.Omg/ml~，杀稻攝菌素-0. 5mg/ml~，杀稻攝菌素中W1. 42mg/ml抑制增殖。
[0066]图9表示ALlAc在平板培养时的最低抑菌浓度。其中，G418-1.Omg/ml~，潮霉素-1.Om邑/ml~。 W67] 图10表示耐药性基因盒的模式图巧F-la启动子、终止子）。[符号的说 明]1. 18S2. 1R3. 2F4.ne〇-p;r〇-3F5.n-G-p;r〇-3F6.n-te;rm-G-4R7.n-te;rm-G-4F8.终 止子5R。
[0068] 图11表示耐药性基因盒的模式图（泛素启动子、终止子）。[符号的说明]1. NdellSSF2. 18s-fug-ubq-R3.Ubpro-Hindlll-R4.Ubp;roG418fuslR日.ubp;roG418fus2F 6. G418ubtersus3R7.G418ubterfus4F8.KpnlterR。
[0069] 图12表示构建的网粘菌-大肠杆菌穿梭载体（shuttle-vector)。
[0070] 图13表示将G418耐受能力作为指标的A.limacinum转化体的评价。
[007U图14表示A.limacinum转化体和野生株的形态比较。 阳07引 图15表示通过W基因组DNA作为模板的PCR的A.limacinum转化体的评价。[符 号的说明]1:转化体1 2:转化体2 3:转化体3 4:转化体4 5:转化体5 6:野生型7:阳 性对照（W导入的DNA片段作为模板）
[0073] 图16表不通过印记杂交（southernblotting)的A.limacinum转化体的评价。 [符号的说明](A)1.阳性对照（476pg的导入DNA) 2.转化体1，甜曰1处理3.转化体1， Pstl处理4.转化体1，化ndlll处理5.转化体l，EcoRl处理6.转化体l，BamHl处理7~ 11.阴性对照（野生型）；度）1.阳性对照（3化g的导入DNA) 2.野生型，Pstl处理3.转 化体5,Pst1处理4.转化体4,Pst1处理5.转化体3,Pst1处理6.转化体2,Pst1处理 7. 转化体1，Pst1处理。
[0074] 图17表示通过RT-PCR的A.limacinum转化体的评价。[符号的说明]1:转化体 1 2 :转化体2 3 :转化体3 4 :转化体4 5 :转化体5 6 :野生型7 :阳性对照（W导入的DNA 片段为模板）8~13 :W总RNA为模板。 阳07引 图18表示金黄色破囊壶菌化aureum)转化体和野生株的形态比较。其中，A为 野生型，B为转化体1，C为转化体2,D为转化体3。
[0076]图19表示通过W基因组DNA作为模板的PCR和印记杂交（southernblotting) 的金黄色破囊壶菌化aureum)转化体的评价。[符号的说明](A)M:(1)X174/Hincll， 入化ndlll1 :无模板2 :阳性对照（导入DM片段）3 :转化体1 4 :转化体2 5 :转化体3 6 :野生型度)P:阳性对照（导入DM2. 5ng) 1 :野生型，Notl处理2 :转化体1，Notl处理 3 :转化体2,Notl处理4 :转化体3,Notl处理。 阳077] 图20表示通过RT-PCR的金黄色破囊壶菌化aureum)转化体的评价。[符号的说 明]Μ:d)X174/HincII，AHindlll1 :转化体1 2 :转化体2 3 :转化体3 4 :野生型5 :阳性 对照（导入DNA片段）6~9 :在1~4中WRNA为模板的PCR(阴性对照）。
[0078] 图21表示通过W基因组DM作为模板的PCR和印记杂交（southernblotting) 的破囊壶菌灯虹austochytriumsp.)ATCC26185转化体的评价。[符号的说明](A)l: 入Hindlll消化 /d)x-174HincII消化 2 :野生型DNA(2F/5R) 3 :野生型DM(仅 2F) 4 :野 生型DNA(仅5R) 5 :转化体-1DNA(2F/5R) 6 :转化体-1DNA(仅2F) 7 :转化体-1DNA(仅 5R) 8 :转化体-2DNA(2F/5R) 9 :转化体-2DNA(仅 2F) 10 :转化体-2DNA(仅 5R) 11 : 转化体-3DNA(2F/5R) 12 :转化体-3RNA(仅2F) 13 :转化体-3RNA(仅5R) 14 :阳性 对照畑/5R) 15 :阳性对照（仅2F) 16 :阳性对照（仅5R)度）1 :λHindlll消化/ Φx-174Hincn消化 2 :转化体-2DNA(2F/4R) 3 :转化体-2DNA(仅 2F) 4 :转化体-2DNA(仅 4R) 5 :转化体-2DNA(3F/4R) 6 :转化体-2DNA(仅 3F) 7 :转化体-2DNA(3F/5R) 8 :转化 体-2DNA(仅5R)(C) 1:野生型，PstI处理2:野生型Hindlll处理3:转化体-IPstI处 理4 :转化体-1，Hindlll处理5 :转化体-2,PstI处理6 :转化体-2,Hindlll处理71 : 转化体-3,PstI处理8 :转化体-3,Hindlll处理10 :阳性对照（lOOng的导入DNA)。
[0079] 图22表不通过RT-PCR的破囊壶菌（T虹austochytriumsp.)ATCC26185转化体的 评价。[符号的说明](A)l:AHindin消化/d)x-174Hincn消化 2 :野生型cDNA(3F/4R)3 : 野生型cDNA(仅3F) 4:野生型cDNA(仅4R) 5:野生型RNA(3F/4R) 6:野生型RNA(仅 3巧7 :野生型RNA(仅4R) 8 :转化体-IcDNA(3F/4R) 9 :转化体-IcDNA(仅3F) 10 :转化 体-1cDNA(仅 4R) 11 :转化体-1RNA(3F/4R) 12 :转化体-1RNA(仅 3巧 13 :转化体-1RNA(仅 4R) 14 :阳性对照（3F/4R) 15 :阳性对照（仅3F) 16 :阳性对照（仅4R)度）1 :AHindlll 消化 /Φx-174HincII消化t2 :转化体-2cDNA(3F/4R) 3 :转化体-2cDNA(仅 3F) 4 :转化 体-2cDNA(仅 4R) 5 :转化体-2RNA(3F/4R) 6 :转化体-2RNA(仅 3F) 7 :转化体-2RNA(仅 4R) 8 :转化体-3cDNA(3F/4R) 9 :转化体-3cDNA(仅 3F) 10 :转化体-3cDNA(仅 4R) 11 : 转化体-3RNA(3F/4R) 12 :转化体-3RNA(仅3F) 13 :转化体-3RNA(仅4R) 14 :阳性对照 (3F/4R) 15 :阳性对照（仅3巧16 :阳性对照（仅4R)。
[0080] 图23表示通过W基因组DNA为模板的PCR的裂殖壶菌（Schizochytriumsp.) ALlAc转化体的评价。[符号的说明]1~3道：转化体4~6道：野生株7道：无模板 DNA(阴性对照）8道拟导入的DNA为模板（阳性对照）。
[0081] 图24表示制得的GFP(绿色巧光蛋白）基因/耐新霉素基因表达盒的模式图。 化-pro-Fl和化-term-R2在序列中分别有化ηI位点。 阳0間图25表示W对照株和GFP基因/耐新霉素基因表达盒导入株来源的基因组DNA作为模板的PCR分析。各自表示如下：Α，Β是Aurantiochytriumsp.mh0186、C，D是金黄 色破囊壶菌化aureum)中PCR结果、W及A,C是耐新霉素基因、B，D是扩增GFP基因的结 果。[符号的说明]Μ:λHindlll消化/Φx-174HincII消化N:野生株（阴性对照）C:耐 新霉素基因表达盒导入株（A，C中是阳性对照/B，D中是阴性对照）T:GFP基因/耐新霉 素基因表达盒导入株P:将GFP基因/耐新霉素基因表达盒作为模板（阳性对照）。
[0083] 图26表示W对照株和GFP基因/耐新霉素基因表达盒导入株来源的c