广谱抗果树病原真菌的解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及解淀粉芽抱杆菌菌株《acinusYTB1407,还设及 该菌株对多种果树病原真菌室内括抗活性及稳定性分析。
【背景技术】
[0002] 果树病害是果树生长发育和结果过程中重要的影响因素，严重的制约了水果的产 量和品质，每年给全球造成了巨大的经济损失。目前仍主要采用化学杀菌剂来防治果树病 害，化学杀菌剂的优点是作用快、效果好、使用方便，能在短期内消灭或控制所发生的病害， 有效减少损失，但大量化学杀菌剂的使用又使人类面临新的问题：大量的农药残留危害人 畜健康，污染环境。因此，新型、高效、无毒的生物农药的开发和利用成为目前研究的热点。
[0003] 括抗菌作为一种生物菌剂，对环境安全，对人畜无威胁，可W有效的避免化学杀菌 剂所带来的一系列问题。同时，目前许多研究表明许多细菌会对植物产生有益作用，如固 氮、促植物生长、抗逆境等，使得括抗菌成为病害防治的一条重要而有效的途径，更将是21 世纪绿色食品生产中病害防治的主攻方向，具有广阔的应用前景。
[0004] 芽抱杆菌是一种安全性高、生长繁殖速度快、抗逆性强的微生物菌株，目前广泛应 用于生物农药、肥料及医学等方面。目前我国已经成功研发和并投入生产了多种芽抱杆菌 商品制剂，主要防治粮食、蔬菜的纹枯病、白粉病、稻攝病等真菌病害，而针对果树真菌病害 的生物制剂很少。目前，研究者通过大量试验筛选到能够括抗多种果树病原真菌的芽抱杆 菌菌株，并初步取得显著成效。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供了一种具有广谱抗菌活性的解淀粉芽抱杆菌及其应用，其菌 体和发酵液具有较强的广谱抗多种果树病原真菌的作用。
[0006]本发明设及解淀粉芽抱杆菌YTB1407应用于多种 果树病原真菌的防治。即一种具有括抗苹果轮纹病、苹果斑点落叶病、葡萄炭痘病、葡萄白 腐病及葡萄霜霉病的解淀粉芽抱杆菌。
[0007] -种具有广谱抗菌活性的解淀粉芽抱杆菌，是从中国山东省烟台市福山区西洋参 种植地采集的西洋参根中分离得到，保藏于中国典型培养物保藏中屯、，其简称为CCTCC，地 址为：湖北省武汉市武昌塔挪山武汉大学保藏中屯、；请求保藏人：山东省烟台市农业科学 研究院；保藏日期为2015年10月12日；保藏编号：CCTCCN0:M2015598,该菌命名为解淀 粉芽抱杆菌BacillusamyloliquefaciensYTB1407。
[0008]本发明的解淀粉芽抱杆菌培养条件简单，在大多数培养基上生长良好，在牛肉膏 蛋白腺琼脂平板生长时菌落为乳白色，中间有突起，表面不光滑，不透明，边缘为不规则形 状，在多种培养基上均不产生色素。通过显微镜观察，该菌为革兰氏阳性菌，有的可见芽抱， 芽抱中生，约1.0X3. 0μπι，菌体杆状，有鞭毛。该菌在葡萄糖发酵反应倒置试管有气泡出 现，淀粉水解反应有透明水解圈生成，过氧化氨酶试验中呈阳性反应，销酸盐还原试验产生 深红色物质，硫化氧反应呈阴性，V-P试验生成红色化合物，梓樣酸盐利用试验平板变蓝色 呈阳性反应；耐盐性试验，在加入5%的氯化钢的平板上可W正常生长。
[0009] 通过16SrDNA同源性分析，该菌株的基因组DNA为模板扩增其16SrDNA序列，PCR 产物为单一条带，回收后纯化，进行DNA测序。该菌株的16SrDNA序列长度为1440bp，将该 菌株的16SrDNA序列提交到GenBank数据库，获得序列号GenBankNO.KT799876。同时将 该菌株的16SrDNA序列与GenBank数据库收录的代表菌株的16SrDNA基因核巧酸序列进 行同源性比对，结果与解淀粉芽抱杆菌和枯草芽抱杆菌菌株的同源性均高达99%。进一步 通过对该菌的gyrA基因片段的扩增、测序和序列同源性比对，结果与解淀粉芽抱杆菌同源 性均高达99%，最终将该菌鉴定为解淀粉芽抱杆菌，并命名为 YTB1407。
[0010] 解淀粉芽抱杆菌《acinusYTB1407的应用中，所述菌体及发 酵液发酵培养条件为：于100ml发酵培养基(容器为250mLΞ角瓶）中按体积接种2%的YTB1407菌株，转速150转/min,培养溫度为30°C，培养4天。发酵培养基配方为：牛肉膏3 邑，蛋白腺 10g，化C1 5g，水 1000 血，pH7.0-8. 0。
[0011] 本发明的解淀粉芽抱杆菌YTB1407的菌体和发酵 液抗菌活性采用平板对時法、菌体生长速率法、叶盘法测定。本发明所述的解淀粉芽抱杆菌 对供试的苹果轮纹病菌、苹果斑点落叶病菌、葡萄炭痘病菌、葡萄白腐病菌、葡萄霜霉病菌 均具有很好的括抗作用。
[0012] 本发明的解淀粉芽抱杆菌YTB1407发酵液中的抗菌物质的热稳定性良好，W 20°C、40°C、60°C、80°C、100°C处理 30min，12rC高压灭菌处理 20min,其抗菌活性除 12rC 高溫处理后有所下降外，其余溫度下抗菌活性基本保留85%W上。本发明的解淀粉芽抱杆 菌YTB1407抗菌物质的酸碱稳定性良好，在抑值2-10范围内非常稳定，活性保留70%W上， 抑为12,抗菌活性明显降低。
[0013] 本发明的解淀粉芽抱杆菌YTB1407的菌体和发酵液均具有较强的广谱的果树真 菌病害抗菌活性，且抗菌效果持久、稳定，具备从中开发出新型、高效、广谱生防杀菌剂的巨 大潜力。
【附图说明】
[0014] 图1解淀粉芽抱杆菌YTB1407的菌落形态； 图2根据16SrDNA基因序列构建的括抗细菌YTB1407菌株的系统发育树； 图3根据gyrA基因序列构建的括抗细菌YTB1407菌株的系统发育树； 图4解淀粉芽抱杆菌YTB1407抗菌结果(平板对時法）； 图5解淀粉芽抱杆菌YTB1407抗菌结果(菌落生长速率法）； 图6解淀粉芽抱杆菌YTB1407抗葡萄霜霉病菌结果(叶盘法）； 图7解淀粉芽抱杆菌YTB1407的热稳定性分析图； 图8解淀粉芽抱杆菌YTB1407抑稳定性分析图。
[0015] 解淀粉芽抱杆菌YTB1407,已于2015年10月12日提交至中国典型培养物保藏中 屯、，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCCN0:Μ2015598。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作更进一步的说明，W便本领域的技术人 员了解本发明。
[0017] 实施例1 解淀粉芽抱杆菌YTB1407的分离和鉴定 中国山东省烟台市福山区西洋参种植地西洋参根部，在实验室按下列条件培养和鉴 定，及可获得本发明的广谱抗菌解淀粉芽抱杆菌YTB1407 : YTB1407的分离和纯化：将西洋参根进行表面消毒，切成小块，在NA固体培养基上培 养。2天后挑取单菌落，采用分区划线法接种于NA固体培养基上，37°C培养1~2天，挑取单 菌落保存。
[0018] 本发明所述的解淀粉芽抱杆菌YTB1407是依据其菌落形态、个体形态学特征、生 理生化特征、16SrDNA和gyrA基因序列的系统发育树等进行鉴定。
[0019] 该菌个体形态与菌落特征如下：细菌YTB1407菌落为乳白色，中间有突起，表面不 光滑，不透明，边缘为不规则形状，见附图1。镜检为革兰氏阳性菌，有的可见芽抱，芽抱中 生，呈楠圆形状，约1.0X3. 0μπι，有鞭毛。其部分生理生化鉴定结果见下表： 表1生理生化鉴定结果
通过16SrDNA同源性分析：该菌株的基因组DNA为模板，利用细菌通 用引物27-F/1492-R进行16SrDNA基因的PCR扩增。引物序列为：27-F: 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492-R: 5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR产物为单一条 带，回收后纯化，进行DNA测序。该菌株的16SrDNA序列长度为1440bp，具体序列见附 件序列表的核巧酸序列。将该菌株的16SrDNA序列提交到GenBank数据库，获得序列号 GenBankNO.KT799876。同时将该菌株的16SrDNA序列与GenBank数据库收录的代表菌 株的16SrDNA基因核巧酸序列进行同源性比对，结果与解淀粉芽抱杆菌和枯草芽抱杆菌菌 株的同源性均高达99%，附图2为根据16SrDNA基因序列构建的括抗细菌YTB1407菌株的 系统发育树。
[0020] 通过gyrA基因同源性分析：根据枯草芽抱杆菌和解淀粉芽抱杆菌的gyrA基 因序列差异性设计一对特异性引物，gyrA-F: 5' -ATGACAAGTGACAAACCTTA-3'，gyrA-R: