大豆根瘤内生菌及其应用，生防菌剂及生物促生菌剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种大豆根瘤内生菌，同时还设及该内生菌的应用，W及采用该内生 菌制备的生防菌剂及生物促生菌剂，属于作物栽培种植及作物病害生物防治技术领域。
【背景技术】
[0002] 小麦是我国大宗作物，但是每年仍依靠施用大量化肥来提高产量，而过量施用化 肥会对±壤结构和生态环境产生极大破坏，同时对有益微生物的生存构成威胁，并且化学 药剂过度使用易诱导病菌产生抗药性，给粮食安全带来严重问题。目前，开发和筛选微生物 促生菌来研发生物促生菌剂，对保持绿色农业和生态环境的可持续发展具有重要意义。
[0003] 上壤微生物如Azospirillumsp. ,Enterobactersp. ,Pseudomonas sp.,Klebsiellasp.,Serratiasp.,Bacillussp.Enterobactersp.,Pantoea sp. ,Liste;riasp.Xanthomonassp. ,Mic;rococ州sspp.等均对作物生长具有促进作用，其 中分离自小麦和草类根际的固氮菌Bacillus能有效提高作物产量和干物质重量，分离自 黑麦草根际的化terobacterludwgii对提高黑麦草茎、根的鲜重和高度有明显的促进作 用，分离自小麦根部的Xanthomonassp.Xs148对冬小麦具有促生长作用，等等。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种大豆根瘤内生菌。
[0005] 同时，本发明还提供一种大豆根瘤内生菌的应用。
[0006] 最后，本发明再提供一种能够抑制小麦赤霉病菌的生防菌剂，W及促进小麦发芽 和幼苗生长的生物促生菌剂。
[0007] 为了实现W上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0008] 大豆根瘤内生菌，其名称为粘质沙雷氏菌（Serratiasp. )DSerl305,保藏编号： CCTCCN0:M2013624,保藏日期：2013年12月1日，保藏单位：中国典型培养物保藏中屯、 (CCTCC)，保藏地址：中国武汉.武汉大学（湖北省武汉市武昌塔挪山武汉大学保藏中屯、）。
[0009] 粘质沙雷氏菌（Serratiasp. )DSe;rl305是从大豆根瘤样品中分离出的一株内生 细菌，经革兰氏染色菌体呈紫色，为革兰氏阳性菌。该菌呈短杆状，大小0. 5X0. 8μηι左右， 无芽抱；菌落呈乳白色，大小3~5mm，边缘圆整、突起有光泽，表面有皱權。
[0010] 大豆根瘤内生菌的应用，包括：粘质沙雷氏菌（CCTCCNO:Μ2013624)在制备铁载 体和/或果胶酶中的应用，在制备抑制小麦赤霉病菌的生防菌剂中的应用，W及在制备促 进小麦发芽和幼苗生长的生物促生菌剂中的应用。此外，还包括在防治小麦赤霉病害、促进 小麦发芽和幼苗生长中的应用。 W11] 用于防治小麦赤霉病害的生防菌剂，其包含粘质沙雷氏菌（CCTCCΝ0:Μ2013624)〇
[0012] 用于促进小麦发芽和幼苗生长的生物促生菌剂，其包含粘质沙雷氏菌（CCTCC N0:M2013624)。
[0013] 本发明的有益效果：
[0014] 本发明中大豆根瘤内生菌为粘质沙雷氏菌（Serratiasp. )DSerl305(保藏编号： CCTCCN0:M2013624)，是从大豆根瘤样品中分离出的一株内生细菌，为革兰氏阳性菌；菌 体呈短杆状，无芽抱，菌落呈乳白色，边缘圆整、突起有光泽，表面有皱權；该菌能产生铁载 体和果胶酶，抗小麦赤霉病菌并促进小麦发芽及幼苗生长，可用于制备生防菌剂和生物促 生菌剂。
[0015] 保藏证明和存活证明说明
[0016] 保藏菌株：粘质沙雷氏菌（Serratiasp.)DSerl305,保藏编号：CCTCCN0:M 2013624,保藏日期：2013年12月1日，保藏单位：中国典型培养物保藏中屯、（CCTCC)，保藏 地址：中国武汉.武汉大学（湖北省武汉市武昌塔挪山武汉大学保藏中屯、）。
【附图说明】
[0017] 图1为粘质沙雷氏菌DSer1305经革兰氏染色后的菌体形态；
[0018] 图2为菌株DSer1305的菌落形态；
[0019] 图3为菌株DSerl305的生长规律曲线图；
[0020] 图4为菌株DSerl305对小麦赤霉病菌的抑制效果；
[0021] 图5为菌株DSer1305产铁载体的图片；
[0022] 图6为菌株DSer1305产果胶酶的图片；
[0023] 图7为接种菌株DSer1305对小麦幼苗生长的影响。
【具体实施方式】
[0024] 下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。 阳〇2引实施例1
[00%] 大豆根瘤内生菌的分离、纯化和保存，包括：
[0027] 1)取河南栽培型大豆根瘤，先用无菌水冲洗根瘤表面4次（3~5次均可），W去除 表面灰尘，再用无水乙醇浸泡25s(20~30s均可），W去除表面极性物质，使用4%次氯酸 钢（3%~5%均可）消毒4min(3~5min均可），然后用无菌水冲洗6次巧~8次均可）， 用无菌綴子夹碎根瘤，将汁液划在牛肉膏蛋白腺培养基表面（配方：牛肉膏3g，蛋白腺lOg， 化Cl5g，琼脂18g，水1000血；自然抑），28°C倒置培养4d(3~5d均可）；
[0028]2)根据菌落特征挑取单菌落反复划线（菌落典型特征为乳白色，边缘圆整、突起 有光泽，表面有皱權），经染色、镜检，直至获得纯种单菌落；
[0029]3)将纯种单菌落接种在牛肉膏蛋白腺斜面培养基上，培养至菌苔饱满，短期保存 在4°C冰箱内，长期保存在30% (v/v)甘油中并置于-80°C冰箱内；同时吸取100μΙ最后 一次冲洗过根瘤的水，涂布在牛肉膏蛋白腺培养基表面，28°C培养4她，观察有无菌落长出， W验证表面消毒的彻底性。
[0030]1、菌体特征
[0031] 大豆根瘤内生菌经革兰氏染色菌体呈紫色，为革兰氏阳性菌（见图1)。该菌呈短 杆状，大小0. 5X0. 8μπι左右，无芽抱；菌落呈乳白色，大小3~5mm，边缘圆整、突起有光 泽，表面有皱權（见图2)。接种在YM液体培养基中，30°C、130巧m振荡培养72h，每小时测 定600nm波长的吸光度值（OD)，生长规律曲线见图3。
[0032] 2、菌株分子鉴定 阳03引大豆根瘤内生菌经16SrDNA序列扩增（引物P1、P6为通用引物，序列见SEQID NO. 2、SEQIDNO. 3,扩增序列大小为1406bp，序列见沈QIDNO. 1，基因序列号KT964299)， 送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。根据测序结果，将扩增得到的序列在GenBank中 进行BLAST分析，用DNAMAN6. 0进行序列相似性分析，16SrRNA结果表明该菌株与Serratia marcescensN-2(JX868557)的相似率为 100%。
[0034] 结合分子鉴定结果及菌体特征，命名该菌株为粘质沙雷氏菌（Serratiasp.) DSerl305,并送至中国典型培养物保藏中屯、保藏，保藏编号：CCTCCN0:M2013624,保藏日 期：2013年12月1日，保藏地址：中国武汉.武汉大学（湖北省武汉市武昌塔挪山武汉大 学保藏中屯、）。 阳0对试验例
[0036] 1、粘质沙雷氏菌DSerl305抑制小麦赤霉病菌特性
[0037] 采用对時培养法测定菌株DSerl305对小麦赤霉病菌的抑制作用，包括：
[0038] 1)制备菌悬液：在超净工作台上用无菌接种环挑取适量DSerl305接种到灭过菌 的牛肉膏蛋白腺液体培养基内（不含琼脂），置于恒溫摇床30°C震荡13化pm培养4d后 (4~5(1均可），1000化/111111冷冻离屯、10111111收集菌体，使用0.9%无菌生理盐水调整菌悬 液00日。。> 1，置于4°C冰箱备用；
[0039] 2)待PDA平板上事先接种的赤霉病菌菌落长至直径2. 5cm(2~3cm均可），用移 液器取同一株菌的菌悬液5μL接种到距离平皿边缘2. 5cm处病原菌落周围，接种3次，呈 "等边Ξ角形"，对照接种等量无菌水；
[0040] 3)每隔24h测量和照相一次，重复3次，并计算抑菌效果，结果见图4及下表1。图 4中A为对照，B为培养7化处理组。
[0041] 抑菌率的计算公式见下式1:
[0042] 式1:抑制率（％ )=(对照菌落直径-处理菌落直径）X100% / (对照菌落直 径）。
[0043] 表1菌株DSerl305对小