一种高效产透明质酸的重组菌的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物的基因工程技术领域，具体涉及一种高效产透明质酸的重组菌 的构建方法。
【背景技术】
[000引透明质酸（HyaluronicAcid,HA)是一种酸性的粘多糖，最早由美国哥伦比亚大学 教授Meyer从牛眼睛玻璃体中分离得到。透明质酸是由等摩尔D-葡萄糖醒酸及N-己醜葡 糖胺组成的高级多糖，分子量在104~107化之间，是胞外基质的重要组成部分。透明质酸 是线性大分子，在水溶液中形成的网状结构赋予其溶液独特的流变学特性和依数性，因此 被广泛应用于医药、化妆品和食品等多个领域。
[0003]目前报道的HA的生产方法有W下3种：天然产物提取法、化学合成法和微生物发 酵法。其中，天然产物提取法是从动物的组织中直接提取HA;化学合成法是通过化学合成 的方法合成"玻璃酸氧氮杂环戊帰衍生物"，然后在降解酶的作用下制备出HA衍生物和酶 的复合体，最后清除酶，获得HA;微生物发酵法是经过微生物进行发酵培养，从发酵液中分 离纯化得到HA。目前，工业生产的HA主要通过天然产物提取法和微生物发酵法获得。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种高效产透明质酸的重组菌地PAB/BW25113的构建 方法。
[0005] 上述方法中，所述的重组菌是将PmHasA蛋白的编码基因和PmHasB蛋白的编码基 因导入宿主大肠杆菌中得到的。
[0006] 上述方法中，所述的PmHasA蛋白的氨基酸序列与SEQIDNo. 2中自N端起第1-972 位氨基酸所示的PmHasA蛋白序列的相似性超过97% ;所述的PmHasB蛋白的氨基酸序列与 SEQIDNo. 4中自N端起第1-390位氨基酸所示的PmHasB蛋白序列的相似性超过97%。
[0007] 上述方法中，所述SEQIDNo. 2中自N端起第1-972位氨基酸所示的PmHasA蛋白 的编码基因的核巧酸序列如SEQIDNo. 1所示；所述SEQIDNo. 4中自N端起第1-390位 氨基酸所示的PmHasB蛋白的编码基因的核巧酸序列如SEQIDNo. 3所示。
[000引上述方法中，所述的Pm化sA蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo. 2中自N端起第1-972 位氨基酸所示；所述的PmHasB蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo. 4中自N端起第1-390位氨 基酸所示。
[0009] 上述所述的宿主大肠杆菌为E.coliBW25113。
[0010] 上述所述的编码基因是通过如下方式导入的：将编码基因插入载体地AD-HisB的 多克隆位点得到重组载体；将重组载体导入宿主菌中。
[0011] 起始载体地AD-HisB含有地R322的复制起始位点、氨予抗性基因、AraC基因 化-阿拉伯糖调苄基因）、araBAD启动子和；rrnB转录终止子，公众可从Invitrogen公司购 买获得，产品目录号；V430-01。
[0012] 宿主菌E.coliBW25113,基因型；F，Δ(araD-araB)567,AlacZ4787(: :rrnB-3), 入，巧h-l，Δ(rhaD-rhaB)568，hsdR514。E.coliBW25113在葡萄糖耗尽，阿拉伯糖存在的 情况下，会启动araBAD启动子下游基因的表达。公众可从北京碧澄藍生物科技有限责任公 司获得，产品目录号为0E巧042。
[0013] 上述所述的重组菌地PAB/BW25113在制备透明质酸中的应用也是本发明的一个 目的。
[0014] 本发明另一个目的是提供一种制备透明质酸的方法。
[0015] 上述所述的透明质酸的制备方法包括如下步骤；诱导上述所述的重组菌地PAB/ BW25113表达所述PmHasA蛋白和PmHasB蛋白，得到诱导后的重组菌；将诱导后的重组菌加 入转化液中，进行生物转化，得到透明质酸。
[0016] 上述方法中，所述转化液的底物为葡萄糖和N-己醜葡萄糖胺。
[0017] 本发明最后一个目的是提供一种重组菌pRXPB/化210E3)。
[0018] 上述所述的重组菌是将SEQIDNo. 4中自N端起第1-390位氨基酸所示的蛋白的 编码基因导入宿主大肠杆菌中得到的。
[0019] 上述所述的SEQIDNo. 4中自N端起第1-390位氨基酸所示的蛋白的编码基因的 核巧酸序列如SEQIDNo. 3所示；所述宿主大肠杆菌为E.coliBL21 (DE3)。
[0020] 上述所述的编码基因是通过如下方式导入的：将编码基因插入载体細isT-pRSET 的多克隆位点得到重组载体；将重组载体导入宿主菌中。
[0021] 起始载体6HisT-pRSET含有地R322的复制起始位点、氨予 抗性基因、T7启动子和T7转录终止子。此载体的构建方法见文献： "TA0,Y.,加ermah,M. ,Martinez,E. ,Ctelge'SChlMg味T. ,Hasegawa,S. ,Takada,R. ,Yama moto,T. ,Horikoshi,M.andRoeder,R.G. (1997)SpecificInteractionsandPotential F^mctionsofHumanTAFIIIOO.JournalofBiologicalQiemistry270:23984-23987."， 公众可从中国科学院微生物研究所获得。
[0022] 宿主菌E.coli化2UDE3)，基因型；F，ompT，hsdSBbBmB)，galdcm值E3)，缺失 了Ion和ompT蛋白酶，含有T7RNA聚合酶基因，在lacUV5启动子控制之下，当有IPTG(乳 糖）诱导时，T7RNA聚合酶基因表达，可W启动T7启动子下游基因的表达。公众可从北京 全世金生物技术有限公司购买获得，产品目录号；CD601。
[0023] 上述所述的重组菌PRXPB/BL21 (DE3)在制备酶活性提高的UDP-葡萄糖脱氨酶中 的应用也是本发明的一个目的。
[0024] 上述所述的UDP-葡萄糖脱氨酶的氨基酸序列如SEQIDNo. 4中自N端起第1-390 位所示。
[00巧]本发明第一次对在大肠杆菌化21中表达的多杀己氏杆菌的UDP-葡萄糖脱氨酶 进行了酶学性质的初步研究。首次使用多杀己氏杆菌的透明质酸合成酶基因PmhasA和 UDP-葡萄糖脱氨酶基因PmhasB在大肠杆菌BW25113中共表达合成透明质酸。
[0026] 本发明一方面提供了高效产透明质酸大肠杆菌工程菌地PAB/BW25113;另一方面 提供了多杀性己氏杆菌的UDP-葡萄糖脱氨酶高效表达菌株pRXPB/^L21 0E3)，并对UDP-葡 萄糖脱氨酶的酶学性质进行了初步研究。
[0027] 本发明与现有的HA发酵技术相比存在W下优点：
[002引（1)本发明所构建的工程菌地PAB/BW25113在普通Η角瓶中进行一次生物转化能 获得l-2g/L的透明质酸，比毛自朝等人构建的大肠杆菌工程菌在普通Η角瓶中的ΗΑ产量 (0. 5-0. 6g/L)高了 3 倍。
[0029] 似HA生物的转化过程可W分为2个阶段，将蛋白诱导过程和生物转化过程分 开，可W减少代谢产物对细胞生长的抑制，实现工程菌的高密度培养，为下游的生物转化节 约成本。1、蛋白表达过程ΦΒΡΑΒ采用的是诱导型启动子，可W调控透明质酸合成酶基因 PmhasA和UDP-葡萄糖脱氨酶基因PmhasB的表达，从而降低其代谢产物对菌体生长的影响， 可W在发酵罐中实现工程菌的高密度培养；2、生物转化过程，简化了转化液的组分，降低了 生产成本，诱导表达后的地PAB/BW25113菌株能进行多次生物转化，总产量可达到4-5g/L， 提高了菌株的利用率和HA的总产量。
[0030] 本发明提供了一种高效产透明质酸的重组菌的构建方法。该方法是将SEQID No. 2中自N端起第1-972位氨基酸所示的PmHasA蛋白的编码基因和SEQIDNo. 4中自N 端起第1-390位氨基酸所示的PmHasB蛋白的编码基因导入宿主大肠杆菌中得到的。本发 明通过实验证明，在普通Η角瓶中，一次转化能获得2g/L的透明质酸。诱导后菌体可W反 复利用，进行多次的转